VEGF啟動子驅(qū)動的CD-TK雙自殺基因系統(tǒng)對Balb-c小鼠大腸癌的治療作用及腫瘤微環(huán)境影響的實驗研究.pdf

1、大腸癌是常見的惡性腫瘤之一,在過去二十多年中世界大多數(shù)國家或地區(qū)的大腸癌發(fā)病率里上升趨勢,每年死于結(jié)腸癌的病例日益增加。在西方國家,大腸癌居于癌癥相關(guān)死亡率的第二位,僅次于肺癌。大腸癌已成為嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一。目前以外科手術(shù)為主和化療、放療為輔的綜合治療是大腸癌主要的治療手段,但對于進展期腸癌來說,療效仍難以令人滿意,術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要因為。基因治療為傳統(tǒng)的治療方法提供了新的輔助治療手段,是未來腫瘤治愈的希望

2、所在。腫瘤的自殺基因療法,又稱酶前藥治療,是通過基因工程的手法將特定的自殺基因?qū)肽[瘤細(xì)胞,自殺基因能編碼產(chǎn)生相應(yīng)的酶,將不具活性的無毒或低毒前體藥物轉(zhuǎn)化為具有短期活性的細(xì)胞毒性代謝產(chǎn)物,從而在腫瘤局部產(chǎn)生針對腫瘤細(xì)胞的高濃度的細(xì)胞毒作用藥物,達到殺死腫瘤細(xì)胞的目的。另外,自殺基因治療尚存在所謂旁觀者效應(yīng)(bystander effect),是指不僅轉(zhuǎn)導(dǎo)自殺基因的腫瘤細(xì)胞在給予前體藥物后被殺死,其相鄰或更遠的未被轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞也可被殺死

3、的現(xiàn)象,旁觀者效應(yīng)明顯擴大了自殺基因的殺傷范圍,因而在理論上,自殺基因治療是具有靶向性和高效性的基因治療手段。
　　 目前較深入研究的自殺基因治療系統(tǒng)有HSV-TK/GCV和CD/5-FC等,但單自殺基因系統(tǒng)存在殺腫瘤效力不足的問題。本課題組從事自殺基因的研究多年,構(gòu)建的CD/TK.雙自殺基因治療系統(tǒng)比CD或TK單自殺基因系統(tǒng)具有更大的優(yōu)越性,在前期對荷瘤裸鼠的研究中,該雙自殺基因治療系統(tǒng)已表現(xiàn)出比單自殺基因系統(tǒng)更強的抗腫瘤作用

4、。但雙自殺基因系統(tǒng)對具有免疫活性的機體是否具有同樣的抗腫瘤作用尚需進一步證實,另外,雙自殺基因系統(tǒng)與腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系尚未明確,有待進一步研究。因此,本實驗以大腸癌CT26細(xì)胞和Balb/c小鼠為對象,研究VEGF啟動子驅(qū)動的CD/TK.雙自殺基因系統(tǒng)對具有免疫活性的大腸癌Balb/c荷瘤小鼠的腫瘤生長、增殖的影響,同時初步闡明雙自殺基因系統(tǒng)對腫瘤微環(huán)境的作用,為提高雙自殺基因的療效提供實驗依據(jù),本實驗可分為三部分:
　　 第

5、一部分VEGF啟動子驅(qū)動的CD/TK雙自殺基因重組腺病毒的培養(yǎng)、擴增、純化和鑒定。
　　 目的:擴增純化出雙自殺基因重組腺病毒Ad-VEGF-GFP-CD/TK,并測定病毒滴度和感染復(fù)數(shù),為下一步的實驗提供雙自殺基因系統(tǒng)。
　　 方法:將本實驗課題組構(gòu)建并保存的Ad-VEGF-GFP-CD/TK重組腺病毒復(fù)蘇,轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞,待293細(xì)胞出現(xiàn)完全病變效應(yīng)后,以凍融法釋放重組腺病毒,用重組腺病毒反復(fù)轉(zhuǎn)染HEK-29

6、3細(xì)胞以擴增病毒,用普通倒置顯微鏡、熒光顯微鏡和電鏡觀察轉(zhuǎn)染情況,最后采用氯化銫密度梯度離心法純化病毒,終點稀釋法測定病毒的滴度。以病毒DNA為模板,用融合基因CD/TK及啟動子VEGF序列的引物進行PCR反應(yīng),將產(chǎn)物電泳以鑒定目標(biāo)基因的存在。
　　 結(jié)果:
　　 復(fù)蘇的重組腺病毒轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞后,于普通倒置光學(xué)顯微鏡下觀察,可見293細(xì)胞病變現(xiàn)象；于熒光顯微鏡下觀察,可見綠色熒光蛋白的表達；于電鏡下觀察,可見大

7、量重組腺病毒顆粒轉(zhuǎn)染進293細(xì)胞。PCR產(chǎn)物電泳后可見2400bp和296bp條帶,與構(gòu)建的目標(biāo)重組腺病毒的插入片段大小相符,證明成功擴增出雙自殺基因重組腺病毒Ad-VEGF-GFP-CD/TK。重組腺病毒滴度一般可達109-1010pfu/ml。MOI=100為最佳感染復(fù)數(shù)。
　　 第二部分 CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)對Balb/c小鼠大腸癌的治療作用
　　 目的:研究CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)對具有免疫活性的大腸癌Bal

8、b/c荷瘤小鼠的治療作用。
　　 方法:大腸癌CT26細(xì)胞培養(yǎng)擴增,以對數(shù)生長期的CT26細(xì)胞皮下接種Balb/c小鼠背部,建立荷瘤小鼠模型；以移植瘤直徑達到0.5cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn),取腫瘤大小均勻、無出血壞死的100只荷瘤小鼠隨機分為重組腺病毒加前藥組(Ⅰ組)、重組腺病毒組(Ⅱ組)、前藥組(Ⅲ組)、陰性對照組(Ⅳ組)四組,每組25只小鼠。依不同組別,分別瘤內(nèi)注射重組腺病毒(Ⅰ組,Ⅱ組)、腹腔注射前藥GCV或5-FC(Ⅰ組,Ⅲ組)或

9、注射生理鹽水(Ⅳ組),共治療2周。觀測開始治療后第3、7、14天腫瘤體積的變化；第15天每組處死15只小鼠,稱瘤重及計算抑瘤率；Tunel法原位檢測腫瘤細(xì)胞凋亡；每組剩余10只小鼠繼續(xù)觀測總生存期。
　　 結(jié)果:
　　 1.用大腸癌CT26細(xì)胞皮下接種法成功地建立Balb/c荷瘤小鼠模型。
　　 2.雙自殺基因系統(tǒng)對大腸癌Balb/c荷瘤小鼠的腫瘤增長有抑制作用。雙自殺基因治療組與非雙自殺基因治療組比較,治療前腫

10、瘤體積差異無顯著性(P均大于0.05),但在治療后第3天、7、14天,小鼠的腫瘤體積差異均有顯著性(P均為0.000),雙自殺基因治療組在治療后各個不同時間點的腫瘤體積較非雙自殺基因治療組明顯減小。治療結(jié)束后,雙自殺基因治療組與非雙自殺基因治療組的瘤重比較,差異也有顯著性(P均小于0.05),雙自殺基因治療組的瘤重較非雙自殺基因治療組減輕。
　　 3.Tund法原位檢測腫瘤細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示雙自殺基因系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的凋亡率有顯

11、著影響,雙自殺基因系統(tǒng)治療組的凋亡率遠高于非雙自殺基因治療組。
　　 4.經(jīng)單療程(2周)治療后,雙自殺基因治療組與非雙自殺基因治療組小鼠的總生存期無顯著性差異(X2=4.382,P=0.223),說明單療程的雙自殺基因系統(tǒng)治療不能影響荷瘤小鼠的總生存期。
　　 第三部分 CD/TK雙自殺基因治療系統(tǒng)對腫瘤微環(huán)境影響的評估
　　 目的:探討CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)對腫瘤微環(huán)境的影響,以及此種影響與雙自殺基因系統(tǒng)的

12、抗腫瘤效應(yīng)關(guān)系。
　　 方法:如第二部分的方法重新建立荷瘤小鼠模型,成瘤標(biāo)準(zhǔn)同前,120只荷瘤小鼠隨機分為重組腺病毒加前藥組(A組)、重組腺病毒組(B組)、前藥組(C組)、陰性對照組(D組)四組,每組30只小鼠；依不同組別,分別瘤內(nèi)注射重組腺病毒(A組,B組)、腹腔注射前藥GCV或5-FC(A組,C組)或注射生理鹽水(D組),共治療2周。用不連續(xù)密度梯度離心法分離腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞；Annexin-V/PI法檢測單個腫瘤

13、細(xì)胞的凋亡率；流式細(xì)胞術(shù)檢測腫痛浸潤淋巴細(xì)胞亞群CD3+CD4+和CD3+CD8+的變化；ELISA法檢測腫瘤組織內(nèi)IFNγ、IL-2、IL-4,IL-12、TNFα的表達；免疫組化法檢測大腸癌組織中CD34、VEGF的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1 Annexin-V/PI法檢測單個腫瘤細(xì)胞的凋亡率。雙自殺基因系統(tǒng)治療組較非雙自殺基因治療組腫瘤細(xì)胞的凋亡率大幅增加,與Tunel法原位檢測腫瘤細(xì)胞凋亡的結(jié)論基本一致。

14、r>　　 2.CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)能影響B(tài)alb/c小鼠腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞和因子的水平。與非雙自殺基因治療組相比,雙自殺基因治療組腫瘤浸潤性T淋巴細(xì)胞CD3+CD4+和CD3+CD8+均升高,并且腫瘤微環(huán)境中IFNγ、IL-2和IL-12的表達水平也增加(P=0.000)；但,雙自殺基因治療組與非雙自殺基因治療組腫瘤微環(huán)境中的IL-4、TNFα的表達水平差異無顯著性(P均大于0.05)。
　　 3.CD/TK雙自殺基因系

15、統(tǒng)能影響腫瘤微血管的生成,治療后的小鼠腫瘤組織微血管密度(MVD)的明顯減小,同時腫瘤組織中的VEGF的表達水平也下降。
　　 全文結(jié)論:
　　 1.本實驗成功包裝、擴增出VEGF啟動子驅(qū)動的CD/TK雙自殺基因重組腺病毒Ad-VEGF-GFP-CD/TK。
　　 2.本實驗成功地建立成瘤率高的大腸癌Balb/c荷瘤小鼠模型。
　　 3.我們發(fā)現(xiàn)CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)對具有免疫活性的大腸癌Balb/c荷

16、瘤小鼠的腫瘤生長同樣具有抑制作用,并能誘導(dǎo)大量腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 4.我們首次觀察到單療程(2周)的CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)治療對Balb/c荷瘤小鼠的總生存期無影響,提示要延長Balb/c荷瘤小鼠的生存期可能需進行多療程的綜合治療。
　　 5.我們發(fā)現(xiàn)雙自殺基因系統(tǒng)能誘導(dǎo)腫瘤浸潤性T淋巴細(xì)胞CD3+CD4+和CD3+CD8+亞群的升高,并使腫瘤微環(huán)境中IFNγ、IL-2和IL-12的表達水平增加,但對IL-4、TNF