hTERT基因啟動(dòng)子調(diào)控靶向自殺基因治療喉癌的研究.pdf

1、目的：研究人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因核心啟動(dòng)子調(diào)控的人單純皰疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韋(HSV-tk/GCV)系統(tǒng)對(duì)喉癌細(xì)胞的特異性殺傷作用及對(duì)喉癌動(dòng)物模型抑瘤率的影響，為解決喉癌基因治療中非特異性殺傷問(wèn)題提供新思路。 方法： (1)PCR擴(kuò)增hTERT啟動(dòng)子與tk基因，回收擴(kuò)增產(chǎn)物并插入pCI-neo載體，構(gòu)建分別由hTERT啟動(dòng)子和CMV啟動(dòng)子調(diào)控的tk基因真核表達(dá)載體pCI/hTERT-tk和pCI/tk

2、。 (2)分別用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染喉癌細(xì)胞Hep-2和正常血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304，新霉素(G418)篩選陽(yáng)性克隆擴(kuò)增。用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)比較兩種細(xì)胞tk基因的表達(dá)情況；給予前藥更昔洛韋(GCV)，MTT法檢測(cè)72h細(xì)胞存活情況；同時(shí)用細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)(TUNEL)法、流式細(xì)胞術(shù)以及電鏡觀察檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 (3)Hep-2細(xì)胞接種裸鼠，分為三組：高劑量實(shí)驗(yàn)組(pCI/hTERT-tk質(zhì)粒DNA，瘤內(nèi)注射，

3、120μg/只)；低劑量實(shí)驗(yàn)組(pCI/hTERT-tk質(zhì)粒DNA，瘤內(nèi)注射，40μg/只)；脂質(zhì)體對(duì)照組(脂質(zhì)體，瘤內(nèi)注射，100μL/只)。成瘤后腹腔注射GCV，每?jī)商鞙y(cè)量皮下移植瘤長(zhǎng)、寬徑，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。24天后處死裸鼠，稱(chēng)取瘤重，計(jì)算瘤重抑制率。 結(jié)果： (1)酶切及測(cè)序證實(shí)成功克隆hTERT基因啟動(dòng)子，成功構(gòu)建了攜帶有hTERT基因啟動(dòng)子的pCI/hTERT-tk真核表達(dá)載體。 (2)hTERT啟動(dòng)

4、子調(diào)控下的HSV-tk/GCV系統(tǒng)對(duì)Hep-2細(xì)胞有明顯的殺傷作用，使43.1％的Hep/hTERT-tk細(xì)胞凋亡；而對(duì)正常細(xì)胞ECV304作用則不明顯。TUNEL檢測(cè)可見(jiàn)Hep/hTERT-tk細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)凋亡特征性陽(yáng)性染色，電鏡下觀察可見(jiàn)核固縮、染色質(zhì)聚集、凋亡小體產(chǎn)生等凋亡表現(xiàn)，而對(duì)照組ECV304細(xì)胞無(wú)此現(xiàn)象。 (3)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，高劑量實(shí)驗(yàn)組和低劑量實(shí)驗(yàn)組瘤重抑制率可達(dá)72.1％和48.2％，顯著高于對(duì)照組，且兩組間差異