hTERT啟動(dòng)子調(diào)控PTEN基因在肝細(xì)胞癌中的靶向抑癌作用.pdf

1、第一部分:PTEN與hTERT在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)意義及其相關(guān)性研究 目的：研究肝細(xì)胞癌組織中PTEN與hTERT的表達(dá)意義，探討兩者在肝細(xì)胞癌中表達(dá)的相關(guān)性。 方法：應(yīng)用免疫組化(SP法)和半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析58例肝細(xì)胞癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織、8例正常肝臟組織中PTEN蛋白及PTENmRNA、hTERT蛋白及hTERTmRNA的表達(dá)情況，并探討二者表達(dá)的相關(guān)性。 結(jié)果：PTEN蛋白明確定位于肝

2、細(xì)胞胞漿內(nèi)。PTENmRNA和PTEN蛋白在肝細(xì)胞癌中的陽性率分別為41.38％(24/58)、44.83％(26/58)，明顯低于癌旁肝組織的陽性率100％(58/58)和正常肝臟組織中的陽性率100％(8/8)，差異具有非常顯著性(p＜0.01)。hTERT蛋白主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿內(nèi)，偶見核內(nèi)表達(dá)。hTERTmRNA和hTERT蛋白在肝細(xì)胞癌中的陽性率分別為82.76％(48/58)和87.93％(51/58)，明顯高于癌旁組織中的

3、陽性率24.14％(14/58)、27.59％(16/58)，差異具有非常顯著性(p＜0.01)，8例正常肝臟組織中hTERTmRNA和hTERT蛋白均為陰性。相關(guān)分析顯示，PTEN與hTERT在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(p＜0.05)。 結(jié)論：PTEN、hTERT在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，有可能成為肝細(xì)胞癌的重要分子生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)，且兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示PTEN可能在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中對(duì)hTERT的活化起著調(diào)控

4、作用。 第二部分:重組真核表達(dá)載體phTERT-PTEN的構(gòu)建 目的：用分子生物學(xué)方法構(gòu)建人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動(dòng)子調(diào)控的抑癌基因PTEN真核表達(dá)載體，用于轉(zhuǎn)染端粒酶陽性的人肝癌細(xì)胞HepG2，以便研究肝細(xì)胞癌的靶向基因治療。 方法：分別對(duì)含hTERT啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pBTdel-279和攜帶人PTEN基因的表達(dá)載體pBP-PTEN進(jìn)行核酸內(nèi)切酶酶切反應(yīng)，鑒定并連接酶切片段，轉(zhuǎn)化、篩選并鑒定重組

5、載體phTERT-PTEN。 結(jié)果：重組載體phTERT-PTEN經(jīng)雙酶切得到1.2kb基因片段，其序列與人PTEN基因序列完全一致。 結(jié)論：成功構(gòu)建了hTERT啟動(dòng)子調(diào)控的抑癌基因PTEN真核表達(dá)載體phTERT-PTEN。 第三部分:phTERT-PTEN重組載體轉(zhuǎn)染及其靶向表達(dá)效果的實(shí)驗(yàn)研究 目的：檢測(cè)重組載體phTERT-PTEN在端粒酶陽性HepG2細(xì)胞中的靶向表達(dá)效果。 方法：將上述實(shí)

6、驗(yàn)中構(gòu)建的hTERT啟動(dòng)子調(diào)控PTEN基因的重組載體phTERT-PTEN以脂質(zhì)體介導(dǎo)方法分別轉(zhuǎn)染端粒酶陽性的HepG2細(xì)胞和端粒酶陰性的人胚肺成纖維細(xì)胞株HELF，G418篩選得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，以免疫熒光細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR和westernblot鑒定重組載體phTERT-PTEN的表達(dá)情況。 結(jié)果：重組載體phTERT-PTEN在端粒酶陽性HepG2細(xì)胞中顯著表達(dá)，在端粒酶陰性的人胚肺成纖維細(xì)胞株HELF則無表達(dá)。

7、 結(jié)論：hTERT啟動(dòng)子在端粒酶陽性HepG2細(xì)胞中能明顯激活phTERT-PTEN重組載體表達(dá)PTEN，實(shí)現(xiàn)了抑癌基因PTEN在人肝癌細(xì)胞HepG2中的靶向表達(dá)效果。 第四部分:重組體phTERT-PTEN在肝癌細(xì)胞中的靶向抑癌作用 目的：研究hTERT啟動(dòng)子調(diào)控PTEN基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞系HepG2細(xì)胞惡性表型及凋亡的影響。 方法：將前述實(shí)驗(yàn)中所構(gòu)建的真核表達(dá)載體phTERT-PTEN及空質(zhì)粒pBP通過脂質(zhì)

8、體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞系中，G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)PTEN基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通過平板克隆形成試驗(yàn)、DNA凝膠電泳、流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR、westernblot、激光共聚焦顯微鏡和透射電鏡，觀察PTEN基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞系HepG2惡性生物學(xué)行為及凋亡的影響。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，經(jīng)免疫組織化學(xué)、RT-PCR和westernblot檢測(cè)證實(shí)有PTENmRNA及其蛋白的表達(dá)；平板克隆形成試驗(yàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)染PTEN基因

9、后，細(xì)胞形成克隆的能力降低；轉(zhuǎn)染PTEN的細(xì)胞在共聚焦顯微鏡和電鏡下可出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變；DNA瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡梯狀條帶；流式細(xì)胞術(shù)顯示PTEN過表達(dá)改變細(xì)胞周期分布，G0/G1期細(xì)胞增加13.61％，S期細(xì)胞下降21.59％，RT-PCR、westernblot結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染重組載體phTERT-PTEN后HepG2過表達(dá)PTEN基因并下調(diào)hTERT的表達(dá)。結(jié)論：hTERT啟動(dòng)子在端粒酶陽性肝癌細(xì)胞HepG2中能