ZHX2基因啟動(dòng)子甲基化在肝細(xì)胞癌中的研究.pdf

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文ZHX2基因啟動(dòng)子甲基化在肝細(xì)胞癌中的研究姓名：呂自力申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：文劍明20060501ZHX2基因啟動(dòng)子甲基化在肝細(xì)胞癌中的研究劑使甲基化的腫瘤抑制基因去甲基化，重新發(fā)揮抑制腫瘤的功能，就有可能成為一種新的腫瘤治療途徑。常見(jiàn)的甲基化抑制劑是胞苷類似物如5雜氮2脫氧胞苷(5Aza2deoxycytidine，5Azadc)，其作用機(jī)制是與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltr

2、ansferase，DNMT)共價(jià)結(jié)合，降低酶的生物活性。許多研究者成功地將5Azadc運(yùn)用在多個(gè)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞株中，逆轉(zhuǎn)了多個(gè)腫瘤抑制基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，使不同的腫瘤抑制基因得以開(kāi)放，進(jìn)而有效地抑制了腫瘤的發(fā)展。目前用于DNA甲基化檢測(cè)的方法很多，有高效液相色譜法(Highperformanceliquidchromatography，HPLC)、甲基化特異性PCR(methylationspecificPCR，MSP)、基因

3、測(cè)序、甲基化敏感性內(nèi)切酶指紋法(MethylationSensitiveRestrictionFingerprinting，MSRF)和細(xì)胞去甲基化培養(yǎng)等方法。這些方法分別能研究單一基因的甲基化及篩選腫瘤相關(guān)的異常甲基化基因。本文的目的在于篩選HCC相關(guān)的異常甲基化基因，并研究該基因異常甲基化在HCC發(fā)生情況，再通過(guò)探討啟動(dòng)子甲基化對(duì)基因表達(dá)的影響進(jìn)而分析腫瘤抑制基因靜息的機(jī)制，為闡明HCC的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。全文共分為四個(gè)部

4、分：一、運(yùn)用MSRF技術(shù)篩選肝細(xì)胞癌中異常甲基化基因收集32例新鮮HCC組織，包括腫瘤組織及瘤旁5cm以外的肝組織，并收集6例血管瘤或膽管結(jié)石旁正常肝組織，提取組織DNA，經(jīng)過(guò)甲基化非敏感性內(nèi)切酶MseI單獨(dú)消化或MseI和甲基化敏感的內(nèi)切酶BstUI聯(lián)合消化DNA，產(chǎn)物分別經(jīng)過(guò)2對(duì)隨機(jī)引物(Bsl／18，Bsl2／13)PCR擴(kuò)增，電泳顯示HCC癌組織與癌旁肝組織及正常肝組織相比有3條異常甲基化片段，長(zhǎng)度分別為200bp、210bp及

5、300bp左右。其中200bp異常甲基化片段出現(xiàn)于3例病例中，210bp及300bp異常甲基化出現(xiàn)于另外2例病例中。通過(guò)回收該異常甲基化片段，與T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5Ci，選取陽(yáng)性克隆測(cè)序，將獲取的序列與人類基因文庫(kù)進(jìn)行類比分析，發(fā)現(xiàn)這3條異常甲基化片段分別與ZHX2(Zincfingersandhomeoboxesprotein2)、MEF2C(myocyteenhancerfactor2C，MADSboxtranscr