肝細(xì)胞癌中3-OST-2基因甲基化的研究.pdf

1、背景:肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前針對(duì)其早期診斷及分子靶向治療的研究日漸成為研究中的熱點(diǎn)。HCC的形成(和發(fā))展受遺傳學(xué)機(jī)制(geneticmechanism)和表觀遺傳學(xué)機(jī)制(epigeneticmechanism)()共同調(diào)控，是一種多基因共同參與的級(jí)聯(lián)調(diào)控過(guò)程，最終導(dǎo)致癌基因的激活或抑煽基因的失活。表觀遺傳學(xué)指不發(fā)生DNA序列改變的基因表達(dá)改變，DNA甲基化和組蛋

2、白修飾是其中的兩個(gè)主要內(nèi)容。近年來(lái)研究顯示，人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與DNA甲基化異常有關(guān)，特異基因的甲基化檢測(cè)可以作為癌癥早期診斷的分子標(biāo)記物、治療的靶點(diǎn)和判斷預(yù)后的手段。3-O-硫基轉(zhuǎn)移酶-2(heparansulfateD-glucososaminyl3-O-sulfotransferase-2，3-OST-2)基因表達(dá)缺失致使硫酸乙酰糖蛋白修飾不完全，與腫瘤發(fā)展有密切關(guān)系，但是具體機(jī)制尚不清楚。DNA甲基化往往與組蛋白修飾相互作用共

3、同調(diào)控基因的表達(dá)。比之DNA甲基化，組蛋白修飾的調(diào)控更為復(fù)雜，不同組蛋白中的不同氨基酸可以發(fā)生多種不同類型的修飾，其中組蛋白乙酰化和去乙?；墙M蛋白修飾中的重要內(nèi)容。新近的研究發(fā)現(xiàn)，UHRF1不僅可通過(guò)DNA解螺旋酶識(shí)別甲基化位點(diǎn)，在確保DNA甲基化的正確復(fù)制中起重要作用，還能識(shí)別甲基化的組蛋白，具有雙重識(shí)別DNA和組蛋白甲基化的功能，但UHRF1如何調(diào)控抑癌基因表達(dá)，在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮怎樣的作用目前尚不清楚。
　　 目的:探討3

4、-OST-2啟動(dòng)子甲基化在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制，檢測(cè)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltrasferases，DNMT)抑制劑5-氮雜-2'，脫氧胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-dC）和組蛋白去乙?；?histonedeacetylases，HDAC)抑制劑曲古菌素A(trichostatinA，TSA)對(duì)HCC細(xì)胞株中3-OST-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平、基因表達(dá)以及對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子UHRF1

5、的影響。
　　 方法:培養(yǎng)HCC細(xì)胞株，實(shí)驗(yàn)分為4組:(1)未加藥HCC細(xì)胞株對(duì)照組;(2)5-Aza-dC單獨(dú)處理組;(3)TSA單獨(dú)處理組;(4)5-Aza-dC+TSA聯(lián)合處理組。采用甲基化特異性PCR(methylation-specificpolymerasechainreaction，MSP)法檢測(cè)藥物作用前后HCC細(xì)胞株中3-OST-2啟動(dòng)子區(qū)甲基化的狀態(tài)改變，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timepolymera

6、sechainreaction，RT-PCR)法檢測(cè)3-OST-2和UHRFlmRNA的表達(dá)變化，采用Westernblotting和細(xì)胞爬片免疫組化法檢測(cè)不同處理組UHRF1蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:3-OST-2在HCC細(xì)胞株中呈完全甲基化狀態(tài)，5-Aza-dC或TSA單獨(dú)均能部分逆轉(zhuǎn)3-OST-2甲基化，mRNA表達(dá)分別增加2.7倍和4.9倍，兩藥聯(lián)合處理后，3-OST-2甲基化被完全逆轉(zhuǎn)，mRNA表達(dá)增加9.1倍。5

7、-Aza-dC或TSA均能降低UHRF-1mRNA和蛋白表達(dá)，TSA比5-Aza-dC療效更好(P＜0.01)，兩藥聯(lián)用具有協(xié)同作用（P＜0.01）。細(xì)胞爬片免疫組化結(jié)果顯示，UHRF1蛋白在HCC細(xì)胞株中陽(yáng)性表達(dá)率較高(94％)，經(jīng)5-Aza-dC處理后UHRF1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率降低為69％;與未加藥HCC細(xì)胞株對(duì)照組相比，差別在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義(P＜0.01)。而TSA處理后UHRF1蛋白表達(dá)顯著下降，陽(yáng)性率為35％，抑制UHRF1蛋白

8、效果明顯好于TSA(P＜0.01);兩種藥物聯(lián)合處理后，UHRF1蛋白陽(yáng)性率降為27％。Westernblotting結(jié)果表明兩種藥物均可抑制UHRF1蛋白表達(dá)，兩藥聯(lián)用效果更為明顯。
　　 結(jié)論:3-OST-2基因表達(dá)降低在HCC中發(fā)揮重要作用。其表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)甲基化和組蛋白去乙酰化共同調(diào)控。UHRF1參與了3-OST-2基因表達(dá)調(diào)控通路中DNA甲基化和組蛋白去乙酰化之間的相互作用，并且對(duì)組蛋白乙酰化的調(diào)控作用大于對(duì)DNA甲基