肝細(xì)胞癌DNA甲基化譜實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(以下簡(jiǎn)稱肝癌)是一種高度惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。至今為止，肝癌發(fā)生的分子機(jī)制仍不明了。基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化異常是肝癌中抑癌基因沉默，腫瘤發(fā)生的重要原因之一。為此，我們擬建立肝癌DNA甲基化譜，探索肝癌發(fā)生表觀遺傳學(xué)機(jī)制，結(jié)合肝癌患者臨床病理資料探討肝癌甲基化譜臨床意義。本研究收集60例天津地區(qū)肝癌、相應(yīng)癌旁、16例肝炎后肝硬化、5例慢性肝炎和5例正常肝組織，篩選消化道腫瘤中經(jīng)常甲基化失活的8個(gè)腫瘤抑制基因，應(yīng)用甲基化特異性

2、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)確定所有標(biāo)本在上述基因中的甲基化狀態(tài)，分別建立上述組織DNA甲基化譜。結(jié)果顯示，上述基因甲基化在肝癌中屬高頻發(fā)事件，該譜系具有中國(guó)地域特征和與乙肝相關(guān)病因特征。癌組織中RASSF1A(95％)、APC(90％)、GSTP1(73.3％)、p16(65％)、RIZ1(61.6％)和MGMT(60％)等基因甲基化率高于癌旁組織(p<0.05)，顯示這些基因甲基化狀態(tài)的腫瘤特異性。癌旁組織MGMT(41.6％)、GSTP1(40

3、％)、RIZ1(25％)等基因甲基化率高于肝硬化組織(p<0.05)，肝癌、癌旁和肝硬化組織中DNA甲基化譜的差異反映了肝癌中漸進(jìn)的表觀遺傳學(xué)改變，同時(shí)也提示，肝臟中GSTP1、RIZ1、MGMT等基因甲基化狀態(tài)具有風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和早期診斷價(jià)值。在肝癌甲基化譜與臨床病例資料的相關(guān)分析中，p16基因甲基化陽(yáng)性患者平均年齡高于陰性患者，顯示p16基因在老化與腫瘤發(fā)生中的雙重作用。巨塊型肝癌中MGMT基因陽(yáng)性患者比例高于陰性患者，MGMT基因甲基化

4、陽(yáng)性患者無(wú)瘤生存期短于陰性患者，顯示了腫瘤中MGMT基因甲基化狀態(tài)的預(yù)后評(píng)估價(jià)值。 區(qū)域癌化是一種腫瘤起源理論，它不僅可用于解釋腫瘤的多發(fā)、復(fù)發(fā)機(jī)制，而且在腫瘤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、預(yù)后判斷、分子邊界和化學(xué)預(yù)防中具有重要價(jià)值，目前該理論已在幾乎所有人類組織、器官中得到證實(shí)，但肝臟中尚無(wú)人報(bào)道。我們通過(guò)肝癌、癌旁、肝硬化等組織甲基化譜比較發(fā)現(xiàn)，癌旁組織中存在具有肝癌特異性而與背景疾病無(wú)關(guān)的DNA甲基化異常，提示肝臟中區(qū)域癌化的存在。進(jìn)一步我們

5、對(duì)比了肝癌與癌旁組織間肝癌特異性基因甲基化譜的一致性，其中39(65％)例患者6基因甲基化狀態(tài)完全一致，21(35％)例患者存在1-3個(gè)基因的不一致，提示肝癌克隆起源的復(fù)雜。在癌旁甲基化譜的生存分析中，RIZ1基因甲基化陽(yáng)性患者無(wú)瘤生存期更短，顯示癌旁部位區(qū)域癌化現(xiàn)象的預(yù)后評(píng)估價(jià)值。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在復(fù)發(fā)病例中，無(wú)論是癌旁RIZ1基因陽(yáng)性病例還是小肝癌病例均有非切緣的局部復(fù)發(fā)趨勢(shì)，提示基于區(qū)域癌化的第二區(qū)域腫瘤在肝癌復(fù)發(fā)中的地位。

6、 DNA甲基化異常并不改變核酸序列，因此與基因突變或缺失不同，腫瘤細(xì)胞中的DNA甲基化異常是可以逆轉(zhuǎn)的，去甲基化治療有望成為腫瘤防治的新型有效途徑。目前研究較多的去甲基化藥物5-氮-2'-脫氧胞苷具有非特異的基因組去甲基化作用，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，但是由于獨(dú)特的藥理特性及潛在的誘發(fā)腫瘤風(fēng)險(xiǎn)，目前該藥僅用于少數(shù)血源性腫瘤的臨床治療，該藥物仍需進(jìn)一步的機(jī)制探討，優(yōu)化用藥方案，拓展抗腫瘤范圍。此外，尋找更多低毒高效的去甲基化替代藥物也是該領(lǐng)

7、域的熱點(diǎn)。中藥苦參堿具有多種抗腫瘤機(jī)制，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，抑癌基因表達(dá)增強(qiáng)，但是否具有去甲基化作用仍不清楚。為此，我們以5-氮-2'脫氧胞苷和不同濃度苦參堿分別處理肝癌細(xì)胞系HepG2，對(duì)處理后細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞存活率、細(xì)胞形態(tài)、甲基化譜、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)等檢測(cè)，探討兩種藥物的抗腫瘤機(jī)理。結(jié)果顯示5-氮-2'脫氧胞苷可成功逆轉(zhuǎn)基因組的高甲基化異常，恢復(fù)抑癌基因表達(dá)，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞阻滯于G2/M期，但是5-氮-2'-脫氧胞苷同樣具有一定

8、的細(xì)胞毒性作用，而且其抗腫瘤作用起效慢，作用時(shí)間長(zhǎng)?？鄥A具有細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)分化兩方面抗腫瘤機(jī)制，其中高濃度苦參堿以細(xì)胞毒性為主，低濃度苦參堿以誘導(dǎo)分化為主。低濃度苦參堿可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，但不能逆轉(zhuǎn)甲基化失活的腫瘤抑制基因，提示其誘導(dǎo)分化作用與去甲基化機(jī)制無(wú)關(guān)。低濃度苦參堿可以誘導(dǎo)p16和p53基因表達(dá)增強(qiáng)，且呈濃度依賴性，結(jié)合此二基因作用途徑與細(xì)胞周期改變的一致性，提示這兩個(gè)基因高表達(dá)是苦參堿誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的重