乙肝肝癌診斷和預(yù)后相關(guān)的DNA甲基化譜研究.pdf

1、肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是第三位最常見的致死腫瘤。在亞洲，尤其是東亞，是肝癌的高發(fā)地區(qū)，肝癌的病因復(fù)雜，其中大多數(shù)是由于肝炎病毒的感染，主要是HBV病毒和HCV病毒。在中國的肝癌患者，大多由于長期的HBV病毒感染，造成慢性肝炎肝硬化后，最終發(fā)展為肝細(xì)胞肝癌。
　　 目前，肝癌的發(fā)病機制仍然不十分清楚，對肝癌的診斷，治療和預(yù)后的判斷主要還是依賴臨床的病理資料和放射學(xué)的檢查。但是放射學(xué)的檢查主要受限于小肝癌和早期肝癌的分

2、辨，而擁有相同的病理資料的患者，肝癌的發(fā)展也相差較大。另外肝癌目前診斷通常過晚，即使通過肝切，肝移植手術(shù)，依然存在著高復(fù)發(fā)，高轉(zhuǎn)移率的風(fēng)險，因此通過找到合適的生物分子標(biāo)志，對患者進(jìn)行合理的診斷和預(yù)后的判斷有重要的意義。
　　 DNA異常的甲基化作為一個重要表觀遺傳學(xué)的改變，被認(rèn)為是一項重要的腫瘤發(fā)病機制。在腫瘤中表現(xiàn)出整體水平的低甲基化和某些局部區(qū)域的高甲基化。在之前的肝癌研究中，GSTP1，RASSF1A，RIZ1，APC，S

3、OCS1和E-cadherin等啟動子區(qū)域等都發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)出異常的高甲基化。隨著全基因掃描技術(shù)的發(fā)展，腫瘤的整體甲基化譜逐漸變得清晰。之前的研究報道發(fā)現(xiàn)一系列潛在的肝癌生物標(biāo)記，但是報道之間能重疊的基因卻很少，這除了芯片平臺本身存在的差異，也發(fā)現(xiàn)不同的病原學(xué)背景，病理生理過程和組織學(xué)特征的肝癌有著不同的整體甲基化譜。
　　 在本次研究中，我們只篩選研究乙肝肝硬化肝癌。在第一部分中將通過全基因的甲基化芯片對肝癌、癌旁和正常肝組織進(jìn)行掃

4、描，探索可以作為潛在的肝癌診斷的生物標(biāo)記。第二部分，對比不同預(yù)后的肝癌標(biāo)本的整體甲基化譜，探索可以作為潛在的判斷肝癌預(yù)后的基因。
　　 第一部分純化的單個乙肝肝癌細(xì)胞的全基因甲基化譜
　　 目的：
　　 之前的研究主要都集中在肝組織的甲基化譜中，肝組織的復(fù)雜組成可能會對肝癌真實的甲基化狀態(tài)產(chǎn)生影響。本研究的目的通過分離純化乙肝肝癌細(xì)胞，來建立乙肝肝癌的整體甲基化譜，探索乙肝肝癌的發(fā)生機制，尋找潛在可作為乙肝肝癌診

5、斷的生物標(biāo)記。
　　 方法和結(jié)果：
　　 純化分離的單個肝細(xì)胞來自乙肝肝癌，通過IlluminaInfiniumHumanMethylation27BeadChips建立整體的甲基化譜。并通過結(jié)合亞硫酸氫鈉處理和酶解分析法及亞硫酸氫鹽測序，對20個在肝癌中顯著高甲基化的基因進(jìn)行驗證。
　　 在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)乙肝肝癌的肝細(xì)胞有獨特的全基因甲基化譜。無監(jiān)督的聚類分析顯示甲基化譜可以被分為三組：肝癌的肝細(xì)胞組，癌

6、旁的肝細(xì)胞組和正常的肝細(xì)胞組。異常甲基化基因主要富集在間隙連接、鈣離子信號通路、細(xì)胞粘附分子、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用、細(xì)胞通訊等信號通路中。在肝癌肝細(xì)胞組的20個最顯著高甲基化的基因中，7個新發(fā)現(xiàn)的基因(WNK2，EMILIN2，TLX3，TM6SF1，TRIM58，HIST1H4F和GRASP)均被證實在肝癌中出現(xiàn)啟動子區(qū)的DNA高甲基化，而在配對的癌旁中則DNA低甲基化，這些發(fā)現(xiàn)在之前肝組織的標(biāo)本中還沒有被報道。
　　

7、 結(jié)論：
　　 乙肝肝癌的肝細(xì)胞存在著特異的甲基化譜可與癌旁和正常肝細(xì)胞相區(qū)別，異常甲基化基因主要富集的信號通路和細(xì)胞永生抑制凋亡相關(guān)。同時新發(fā)現(xiàn)七個基因(WNK2，EMILIN2，TLX3，TM6SF1，TRIM58，HIST1H4F和GRASP)啟動子的高甲基化可作為潛在的乙肝肝癌診斷的生物標(biāo)記。
　　 第二部分乙肝肝癌肝移植術(shù)后與預(yù)后相關(guān)的甲基化譜研究
　　 目的：
　　 由于肝癌的高復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移率

8、，肝移植術(shù)后患者的預(yù)后依然欠佳。目前尚缺少早期復(fù)發(fā)肝癌整體甲基化譜的研究，也缺少能準(zhǔn)確判斷肝癌預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記以篩選出高危病例，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床治療。本實驗的目的就是要建立乙肝肝癌早期復(fù)發(fā)病例的整體甲基化譜，篩選出與乙肝肝癌復(fù)發(fā)相關(guān)的異常甲基化的基因，并評估其在肝移植術(shù)后乙肝肝癌復(fù)發(fā)預(yù)測中的價值。
　　 方法和結(jié)果：
　　 應(yīng)用illuminaInfinium27kHumanDNAmethylationBeadChip對兩

9、組各三例肝移植術(shù)后不同預(yù)后的乙肝肝癌組織進(jìn)行全基因組的甲基化基因掃描，同時以配對的癌旁和正常肝組織作為對照。用隨機方差模型找到四組1164個差異甲基化位點，用差異甲基化基因表達(dá)趨勢分析，篩選出300個與乙肝肝癌復(fù)發(fā)相關(guān)的基因(P<0.05)。通過對特異基因進(jìn)行疾病差異顯著性功能分析、信號通路分析和信號網(wǎng)絡(luò)分析，我們挑選了16個基因進(jìn)行進(jìn)一步篩選。通過臨床樣本中這些基因的表達(dá)量和啟動子甲基化驗證，發(fā)現(xiàn)HIST1H2BH、SOCS2的啟動子