循環(huán)甲基化DNA作為胃癌診斷和預警標志物及胃癌細胞周期基因表達譜的研究.pdf

1、目的：從DNA甲基化角度尋找胃癌診斷和預警的標志物，研究標志物之一的MYLK在胃癌進展中的生物學功能及其作用機制。此外，為探討胃癌發(fā)生的機制，研究胃癌細胞周期各時相轉換過程中基因表達譜的變化。
　　 方法：通過NimbleGen啟動子區(qū)域CpG島芯片，對9株胃癌細胞株和6例正常胃粘膜組織的DNA進行啟動子區(qū)域甲基化檢測，篩選出胃癌高甲基化基因作為候選的胃癌診斷和預警標志物。然后用甲基化特異性PCR(MSP)方法分別在58例胃癌患

2、者(術前/術后)、46例胃癌癌前疾病患者(不典型性增生、腸化生和慢性萎縮性胃炎)和30例健康人的血清標本中驗證，并對候選標志物分子做臨床病理學參數(shù)相關性分析。
　　 以免疫組化染色檢測62對胃癌患者的腫瘤組織及其對應癌旁組織中MYLK的表達。分別從胃癌患者腫瘤和癌旁組織中分離、培養(yǎng)原代腫瘤相關成纖維細胞(CAFs)和癌旁成纖維細胞(CPFs)，并檢測MYLK在其中的表達。以siRNA方法下調(diào)CAFs中MYLK的表達，并將下調(diào)前后

3、的CAFs分別與胃癌細胞SGC7901共培養(yǎng)，觀察單獨培養(yǎng)的SGC7901細胞(SGC7901組)，和CAFs共培養(yǎng)的SGC7901細胞(SGC7901+CAFs組)，及其和MYLK下調(diào)后的CAFs共培養(yǎng)的SGC7901細胞(SGC7901+CAFs-MYLK(-)組)增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的變化。以細胞因子芯片檢測CAFs和SGC7901細胞共培養(yǎng)上清、單獨CAFs、SGC7901細胞培養(yǎng)上清中細胞因子的差異。觀察CAFs和SGC

4、7901細胞共培養(yǎng)后以及外源性HGF、IGFBP-1和MYLK特異性抑制劑作用于CAFs后，MYLK表達、CAFs生物學特性及SGC7901細胞后上皮間質(zhì)轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的改變。
　　 以胸腺嘧啶核苷(thymidine)-偌考達唑(Nocodazole)及雙胸腺嘧啶核苷(doublethymidine)法進行細胞同步化，分別阻斷并于釋放后0-12h收集細胞，流式

5、細胞儀檢測細胞同步化的程度。選擇細胞周期中9個不同關鍵時間點的細胞樣本并抽提mRNA，用cDNA microarray分析基因表達譜差異。
　　 結果：甲基化芯片篩選出82個差異基因，其啟動子區(qū)域在胃癌中高甲基化，正常胃粘膜中低甲基化或未發(fā)生甲基化。MSP檢測候選基因BCAS4、CHRM2、FAM5C、PRAC和MYLK在胃癌患者、胃癌癌前疾病患者和健康人血清中的甲基化陽性率：BCAS4分別為32.8％(19/58)、54.4％

6、(25/46)和100％(30/30)；CHRM2分別為31.0％(18/58)、15.2％(7/46)和6.7％(2/30)；FAM5C分別為31.0％(18/58)、6.5％(3/46)和3.3％(1/30)；PRAC分別為65.5％(38/58)、28.3％(13/46)和36.7％(11/30)；MYLK分別為70.7％(41/58)、28.3％(13/46)和6.7％(2/30)。CHRM2，F(xiàn)AM5C和MYLK的甲基化陽性率

7、隨病情進展呈正相關性。其中胃癌患者血清中FAM5C和MYLK在胃癌患者術后血清中的甲基化陽性率較術前有明顯下降(P<0.001)。評價甲基化聯(lián)合檢測用于胃癌診斷意義的ROC曲線，F(xiàn)AM5C和MYLK聯(lián)合檢測的曲線下面積(AUC=0.838)高于單個基因(0.639和0.820)。FAM5C和MYLK甲基化聯(lián)合檢測在胃癌患者和癌前疾病患者中的敏感性分別達到77.6％(45/58)和30.4％(14/46)，特異性達到90％。FAM5C和M

8、YLK聯(lián)合甲基化檢測陽性率術后為24.1％(14/58)，明顯低于術前的77.6％(45/58)(P<0.001)。FAM5C和MYLK聯(lián)合甲基化檢測與腫瘤大小(P<0.001)、腫瘤浸潤深度(P=0.001)和TNM分期(P=0.003)有相關性。
　　 組織免疫組化染色顯示62例胃癌腫瘤和癌旁組織標本中有45例(72.6％)MYLK表達于腫瘤組織的間質(zhì)細胞，而在腫瘤細胞中不表達或低表達；在45例間質(zhì)表達的標本中有27例(60

9、％)MYLK的表達腫瘤組織中高于癌旁組織。原代成纖維細胞CAFs中的FAP、α-SMA和MYLK的mRNA表達量高于CPFs(P<0.05)。與CAFs共培養(yǎng)后SGC7901細胞的增殖能力明顯升高(P=0.018)；而與SGC7901+CAFs組相比，將CAFs中的MYLK下調(diào)后則不能增加SGC7901細胞的增殖能力，差別有統(tǒng)計學意義(P=0.046)。與CAFs共培養(yǎng)后SGC7901細胞的凋亡率雖有所下降，但無統(tǒng)計學意義的差異(P=0

10、.169)；而與SGC7901+CAFs組相比，將CAFs中的MYLK下調(diào)后則明顯促進SGC7901細胞的凋亡(P=0.032)。與SGC7901組相比，SGC7901+CAFs組SGC7901細胞的遷移(37.2±15.992 vs77.7±13.483，P<0.05)和侵襲(28.1±3.315 vs59.1±7.141，P<0.05)增加；與SGC7901+CAFs組相比，SGC7901+CAFs-MYLK(-)組SGC7901細

11、胞的遷移(77.7±13.483 vs61.0±13.132，P<0.05)和侵襲(59.1±7.141 vs50.8±5.160，P<0.05)減少。CAFs和SGC7901細胞共培養(yǎng)后，HGF和IGFBP-1細胞因子表達均明顯升高。CAFs與SGC7901細胞共培養(yǎng)后或?qū)⑼庠葱缘腍GF或IGFBP-1作用于CAFs后，CAFs中FAP、α-SMA和MYLK的mRNA表達明顯升高(P<0.05)；而抑制CAFs中MYLK的活性后，F(xiàn)A

12、P、α-SMA和MYLK mRNA表達明顯降低(P<0.05)。同時SGC7901細胞與CAFs共培養(yǎng)后或?qū)⑼庠葱缘腍GF和IGFBP-1作用于SGC7901細胞后，其EMT標志物E-cadherin mRNA表達降低，而N-cadherin、Twist1、Twist2、Snail、Slug mRNA表達升高，具有明顯的EMT特征性變化(P<0.05)。
　　 表達譜芯片篩選出得到2001個在9個時間點均可信的基因，其中959個

13、基因在細胞周期中發(fā)生明顯的上調(diào)或下調(diào)。其中細胞生長相關基因有2個，細胞凋亡相關基因有12個，細胞周期相關基因有16個，染色質(zhì)蛋白相關基因有7個，DNA復制相關基因有4個，轉錄相關基因有56個，DNA修復相關基因有2個，蛋白質(zhì)合成相關基因有91個，癌基因15個，黏附分子相關基因8個，信號轉導相關基因101個，細胞結構基因33個，代謝相關基因160個，其他未分類的基因有448個。
　　 結論：血清FAM5C和MYLK聯(lián)合甲基化檢測在

14、胃癌和癌前疾病中的敏感性和特異性均高于目前臨床上的一般檢測手段；可用于評估手術效果和監(jiān)測復發(fā)；并能對臨床病理分期和腫瘤浸潤深度起到一定的提示作用，有望成為胃癌診斷和預警的標志物。
　　 CAFs可促進胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT。MYLK是調(diào)控胃癌CAFs生物學特性的一個重要分子，并有可能成為潛在的CAFs活化標志物。
　　 胃癌細胞周期各時相轉換過程中發(fā)生廣泛的基因表達譜改變，為胃癌發(fā)生機理的闡明提供了研究基礎。