p73和HOXAll基因在胃癌中的甲基化及表達(dá)研究.pdf

1、背景和目的:
　　胃癌(gastric carcinoma，GC)是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居所有癌癥新發(fā)病例的第四位，死亡率居癌癥相關(guān)死亡的第二位。胃癌的發(fā)生是一個(gè)多基因參與、外部因素促進(jìn)的多階段的復(fù)雜過(guò)程，主要涉及遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)兩個(gè)方面，把兩者結(jié)合起來(lái)研究，為更好地闡明惡性腫瘤的進(jìn)展提供了新的思路。其中DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)研究最深入的一種形式。啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化導(dǎo)致的抑癌基因沉默被認(rèn)為是腫瘤抑制基因失

2、活的重要機(jī)制之一，在胃癌的發(fā)生過(guò)程中起重要作用。
　　p53是廣泛存在的抑癌基因，其突變?cè)谀[瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。p73基因是p53基因家族中的新成員，與p53基因具有高度的同源性。p73基因在不同的啟動(dòng)子調(diào)控下能編碼兩種具有相反功能的蛋白:TAp73和ΔNp73。全長(zhǎng)的TA-p73異構(gòu)體可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有和p53基因相似的功能，被認(rèn)為是候選的抑癌基因，在腫瘤發(fā)生和細(xì)胞凋亡中的作用成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。而截短的ΔNp73異

3、構(gòu)體由于缺少轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，可以對(duì)抗p53誘導(dǎo)凋亡的作用，與p53基因具有相反的生物學(xué)功能。研究表明，p73基因甲基化與神經(jīng)膠質(zhì)瘤、多發(fā)性骨髓瘤和結(jié)腸癌等有關(guān)，在胃癌中關(guān)于p73甲基化的研究很少。
　　HOX基因是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化中起重要作用，還參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，p53基因的啟動(dòng)子區(qū)有HOX基因通用序列的結(jié)合位點(diǎn)，因此HOX基因可以調(diào)節(jié)p53的表達(dá)，HOX編碼的蛋白可以增強(qiáng)抑癌基因p53

4、的功能。HOXA11基因是HOXA家族中的一員，在生殖系統(tǒng)腫瘤中普遍存在HOXA11基因高甲基化和低表達(dá)的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，HOXA11可能通過(guò)上調(diào)p73基因的表達(dá)，抑制腫瘤的發(fā)生。
　　本研究檢測(cè)了p73和HOXA11基因在胃癌組織、癌旁組織和正常對(duì)照組織中的甲基化情況及表達(dá)水平，初步分析p73和HOXA11基因甲基化水平對(duì)其基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討p73和HOXA11基因異常甲基化在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　材料和方

5、法:
　　收集河南大學(xué)淮河醫(yī)院2012年05月至2013年03月之間胃癌手術(shù)切除標(biāo)本32例，每例標(biāo)本分別取癌組織和相應(yīng)的癌旁組織(距癌組織＞5cm)，所取組織離體后立即一分為二，一份置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫硪环菀?0％甲醛溶液固定，制作常規(guī)病理切片，HE染色，確定病理診斷。所有胃癌患者術(shù)前均未行放、化療和其他治療，組織學(xué)類型均為腺癌，其中男性20例，女性12例，年齡36～85（平均（63.4±12.1））歲。正常對(duì)照組織10

6、例，均為淺表性胃炎患者。所有組織獲取均征得患者、家屬及本單位知情同意。
　　用亞硫酸氫鹽測(cè)序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)檢測(cè)p73和HOXA11基因的甲基化水平。用Trizol（Takara公司）法提取組織總RNA，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)提取RNA的質(zhì)量和濃度;按照北京康為世紀(jì)公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作步驟合成cDNA;采用熒光定量PCR(RT-PCR)方法檢測(cè)p73和HOXA11基因mRNA的

7、表達(dá)水平。采用免疫組織化學(xué)方法（Immunohistochemistry，IHC）和蛋白印跡法(western blot)分別檢測(cè)胃癌組織中p73和HOXA11基因蛋白的表達(dá)水平。分析p73和HOXA11基因甲基化與胃癌臨床病理因素的相關(guān)性。數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、胃癌組織和癌旁組織中p73和HOXA11基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平均高于正常胃粘膜組織(P＜0

8、.05)，胃癌組織和癌旁組織之間的甲基化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。TNMⅢ期和Ⅳ期胃癌患者中p73和HOXA11基因的甲基化水平高于TNMⅠ和Ⅱ期的患者(P＜0.05)。
　　2、TAp73 mRNA在胃癌組織的相對(duì)表達(dá)量較正常胃粘膜組織降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ΔNp73 mRNA在胃癌組織的相對(duì)表達(dá)量較正常胃粘膜組織升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。HOXA11基因mRNA在胃癌組織中的表達(dá)

9、量低于正常胃粘膜組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、免疫組化結(jié)果顯示，TAp73蛋白在胃癌組織中的表達(dá)低于正常胃粘膜組織，ΔNp73蛋白在胃癌組織中的表達(dá)高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。HOXA11蛋白在胃癌組織表達(dá)和正常胃粘膜組織相比降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、免疫印跡結(jié)果顯示，TAp73蛋白在胃癌組織中的表達(dá)低于正常胃粘膜組織(P＜0.05)。胃癌組織和正常胃粘膜組