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文檔簡介
1、胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個涉及多種基因改變的復雜過程,包括抑癌基因的表達缺失及癌基因的激活。正常上皮特異性-1(normalepithelialcell-specific1,NES1)基因,又稱Kallikren10,是近年來新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關,對腫瘤患者的病情監(jiān)測、估計預后、療效評價、檢測疾病復發(fā)等具有重要作用。NES1在胃癌中的作用尚未完全了解。 目的:研究了NES1基因與胃癌發(fā)生發(fā)展的關系及其表達缺失的
2、相關機制,這將有助于我們更深入認識胃癌的發(fā)生機制,并為今后胃癌的早期診斷和治療奠定了基礎。 方法:1.用Real-timePCR和westernblot分別檢測NES1基因mRNA和蛋白在胃癌細胞株中的表達。抽提NES1基因表達缺失的胃癌細胞株DNA,用亞硫酸氫鈉(NaHSO4)修飾,采用測序和甲基化特異性PCR(MSP)兩種方法檢測NES1基因在胃癌細胞株中的表達及其與CpG島甲基化的關系。去甲基化藥物處理NESl基因表達缺失
3、的胃癌細胞株,觀察處理前后NES1基因mRNA表達的變化,進一步驗證NES1基因在胃癌細胞株中的表達與CpG島甲基化的關系。2.采用免疫組化和原位雜交的方法分別檢測胃癌活檢標本中NES1基因mRNA和蛋白的表達,探討NES1基因在胃癌組織中的表達及其臨床病理聯(lián)系。3.用激光顯微切割的方法分離胃癌組織中的癌細胞通過Real-timePCR檢測NES1mRNA的表達。通過甲基化特異性PCR(MSP)及亞硫酸鹽修飾后基因組測序(BSP)兩種方
4、法檢測相應癌細胞中NES1基因的甲基化狀態(tài),探討NES1基因在胃癌組織中的表達及與甲基化狀態(tài)的關系。4.通過基因重組構建NES1基因真核表達質粒,轉染至胃癌細胞株建立穩(wěn)定高表達NES1基因的胃癌細胞克??;觀察細胞增殖情況;應用基因腫瘤表達譜芯片分析轉染前后腫瘤相關基因表達的變化,探討NES1基因可能的抑癌機制,并用Real-timePCR對部分相關基因的表達進行驗證。 結果:1.NES1基因在5種不同分化類型的人胃癌細胞株中的表
5、達明顯低于正常對照組(p<0.01)。在NES1表達降低的胃癌細胞株中其外顯子3CpG島存在部分或完全甲基化。去甲基化藥物可恢復NES1mRNA在胃癌細胞株中的表達缺失并呈一定的濃度依賴性,提示NES1在胃癌細胞株中的表達缺失與CpG島異常甲基化有關。2.NES1蛋自在胃癌活檢組織標本中的表達明顯低于正常組織標本,具有顯著性差異(P<0.05)。其蛋白表達與年齡、性別、幽門螺桿菌感染、病理分型等差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。NES1
6、mRNA在胃癌活檢組織標本中表達的陽性率及強度均顯著低于正常組織標本(P<0.01),其表達降低程度與病理分型密切相關(P<0.05),與年齡、性別、幽門螺桿菌感染、病灶的大小、數(shù)目等因素無關(p>0.05)。3.NES1mRNA在顯微切割后胃癌組織細胞中的表達明顯低于周圍正常組織細胞(P<0.05)。胃癌組織細胞中NES1基因外顯子3CpG島具有高比率的異常甲基化現(xiàn)象,進一步證實了NES1基因甲基化是胃癌發(fā)生的分子病理學改變。4。穩(wěn)定
7、高表達NES1基因可以抑制胃癌細胞的增殖。基因芯片記結果提示NES1基因轉染后引起廣泛的基因變化,這些差異表達的基因功能涉及多個方面包括信號傳導,細胞周期調控,細胞凋亡,細胞增殖及轉移等。推測NES1基因的抑癌作用可能是通過參與調節(jié)腫瘤相關基因的表達而發(fā)揮抑瘤作用的。 結論:NES1基因外顯子3CpG島異常甲基化是其在胃癌細胞株和胃癌組織中特異性表達缺失的機制之一。NES1mRNA表達水平與胃癌組織分化程度相關,提示NES1基因
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