LTF基因在胃癌內(nèi)的表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化相關(guān)性探索.pdf

1、目的:
　　胃癌是全世界范圍內(nèi)癌癥導(dǎo)致死亡的最常見原因之一。其腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制主要涉及遺傳性因素改變和表觀遺傳學(xué)因素改變的堆積。而后者主要包含DNA甲基化，雜合性丟失以及組蛋白修飾三方面。近來有很多的文獻(xiàn)證明在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化這一機(jī)制占有重要的地位。新近研究發(fā)現(xiàn)LTF基因有抑癌作用，其在多種腫瘤里表現(xiàn)為低表達(dá)和表達(dá)缺失，且機(jī)制與LTF啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中我們主要研究一下內(nèi)容:
　　

2、1.檢測胃癌組織及四種胃癌細(xì)胞株(SGC7901,MGC803，BGC823，AGS）內(nèi)LTF基因的mRNA表達(dá)情況，了解該四種胃癌細(xì)胞株內(nèi)LTF表達(dá)水平，分析目的基因LTF表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。
　　2.檢測目的LTF基因在胃癌組織及相應(yīng)的四種細(xì)胞株中的啟動(dòng)子甲基化情況，探索其DNA甲基化情況和LTF在胃癌里表達(dá)水平的相關(guān)性。
　　3.四種胃癌細(xì)胞株用去甲基化劑5-aza-CdR處理后，分別檢測LTF基因mRNA，

3、蛋白表達(dá)水平及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化率的改變。分析5-aza-CdR對(duì)胃癌細(xì)胞株甲基化率的作用，進(jìn)一步深入研究LTF基因表達(dá)和其啟動(dòng)子區(qū)甲基化的關(guān)系。
　　方法:
　　1.用亞硫酸氫鹽測序方法(bisulfite genomic sequencing PCR，BSP)檢測胃癌組織和胃癌細(xì)胞株(SGC7901，MGC803，BGC823，AGS)的LTF基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。
　　2.胃癌組織和四種胃癌細(xì)胞株內(nèi)LTF的mRN

4、A表達(dá)水平使用熒光定量PCR方法(Realtime PCR)檢測。
　　3.四種胃癌細(xì)胞株內(nèi)LTF基因的蛋白表達(dá)水平使用蛋白印跡法(Western blot)檢測。
　　4.用去甲基化劑5-aza-CdR處理四種胃癌細(xì)胞株，我們按不同的藥物濃度分為三組，0μmol/L，2μmol/L，10μmol/L，以0μmol/L為對(duì)照組，余濃度為藥物處理組。培養(yǎng)5天后，分別檢測LTF基因的mRNA，蛋白表達(dá)及啟動(dòng)子甲基化率。
　

5、　結(jié)果:
　　1.在胃癌組織內(nèi)LTF的mRNA相對(duì)表達(dá)(2-ΔΔCt)的平均值為0.752，較癌旁正常低(癌旁正常組織設(shè)定為1.00)(P＜0.05)。LTF基因在4個(gè)胃癌細(xì)胞株內(nèi)表達(dá)亦是降低(P＜0.001)，結(jié)果與胃癌組織內(nèi)一致。胃癌里L(fēng)TF表達(dá)與患者年齡，性別，淋巴轉(zhuǎn)移和腫瘤大小等臨床特征無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(P＞0.05)。
　　2.胃癌組織(38.21％)中LTF基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率明顯高于癌旁正常對(duì)照(18.10％)，

6、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.5-aza-CdR處理四種胃癌細(xì)胞株5天后，SGC7901，MGC803，BGC823各藥物處理組較對(duì)照組總體甲基化率下降(P＜0.05)，且LTF表達(dá)較對(duì)照組升高(P＜0.05)，但兩個(gè)藥物處理組間的總體甲基化率和LTF表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，即這三種胃癌細(xì)胞株對(duì)5-aza-CdR去甲基化作用不存在濃度依賴。胃癌細(xì)胞株AGS在藥物處理前后LTF的mRNA表達(dá)和啟動(dòng)子區(qū)總體甲

7、基化率無統(tǒng)計(jì)性差異(P＞0.05)。
　　4.去甲基化劑作用于3種胃癌細(xì)胞株(SGC7901，MGC803，BGC823)后，LTF基因啟動(dòng)子區(qū)包含的14個(gè)CpG位點(diǎn)各甲基化率改變是不一樣的。在胃癌細(xì)胞株SGC7901內(nèi)3，9，10和11號(hào)這四個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化率下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在MGC823中3，4，5，10，11，12，13號(hào)這七個(gè)CpG位點(diǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在BGC823中僅有3和8號(hào)CpG位點(diǎn)改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余位點(diǎn)的甲基