甲狀腺乳頭狀癌中RUNX3基因啟動子甲基化及其蛋白表達(dá)的相關(guān)性.pdf

1、目的:
　　 甲狀腺癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的1％，近年來其發(fā)展率呈上升趨勢。甲狀腺癌按病理類型可分為：乳頭狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌和未分化癌。其中，乳頭狀癌是最常見的甲狀腺惡性腫瘤，約占甲狀腺癌的60％～70％。目前，雖然對甲狀腺癌的癌變機(jī)制取得一定的進(jìn)展，但是具體的分子生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段、多基因參與的長期復(fù)雜的過程。基因序列的改變?nèi)缁蛲蛔?、基因雜合性缺失、微衛(wèi)星不穩(wěn)定等可導(dǎo)致

2、腫瘤的發(fā)生，然而近來發(fā)現(xiàn)某些腫瘤抑制基因其基因序列完整并未發(fā)現(xiàn)突變、缺失等變化，利用經(jīng)典的遺傳控制理論難以解釋此現(xiàn)象。表遺傳學(xué)（epigenetics）是指發(fā)生在基因表達(dá)水平上的可遺傳的、無DNA序列改變。主要包括DNA甲基化和組蛋白去乙?；渲?，DNA甲基化是表遺傳學(xué)調(diào)控的主要方式。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)上研究最深入的一種機(jī)制，被認(rèn)為是繼突變、等位基因丟失后致抑癌基因失活的第二次打擊。目前研究發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤中存在RUNX3的失活，

3、包括胃癌、肺癌、膽管癌、胰腺癌和肝細(xì)胞癌等，其失活的機(jī)制主要是基因啟動子區(qū)域CpG島的甲基化。Runx3基因在甲狀腺乳頭狀癌中基因啟動子甲基化及其蛋白表達(dá)缺失的關(guān)系國內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。為此，我們首先運(yùn)用甲基化聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)來從DNA水平檢測PTC中Runx3基因的啟動子甲基化情況，并分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。來探討Runx3基因在甲狀腺乳頭狀癌中失活的可能機(jī)制，進(jìn)而來評判Runx3基因是否是甲狀腺癌的候選抑癌基因。其次，為證

4、明由于基因啟動子區(qū)的高甲基化而導(dǎo)致基因表達(dá)下調(diào)或缺失，我們運(yùn)用半定量RT-PCR法從RNA水平檢測Runx3基因在PTC中的轉(zhuǎn)錄情況，并分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。最后，為近一步證明mRNA轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)的一致性，我們運(yùn)用Westem blot法從蛋白水平檢測Runx3基因在PTC中的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。通過MSP、RT-PCR、Western-blot來進(jìn)一步探討Runx3抑癌基因在甲狀腺乳頭狀癌中發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)

5、移侵襲中的作用，尋求腫瘤治療的靶點(diǎn)，為臨床上的腫瘤篩選及預(yù)后提供生物學(xué)標(biāo)記作為依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 1.56例PTC及其切緣與癌灶相隔2cm的非癌上皮(non-carcerous epithelium，NCE)組織，均經(jīng)病理證實(shí)，分別取自2008年1月至2010年3月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)標(biāo)本。所有病例術(shù)前均未接受化療、放療及其他免疫治療。標(biāo)本放入液氮后保存于-80℃低溫冰箱中，一部分用于提取DNA和甲基化

6、修飾用于MSP反應(yīng)，一部分用于提RNA和蛋白用于RT-PCR及Westem blot檢測。
　　 2．采用MSP法檢測Runx3基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。采用RT-PCR及Westem blot法從RNA及蛋白水平檢測Runx3基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況。
　　 3．采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)處理兩樣本率的比較采用四格表資料的X2檢驗(yàn)，兩樣本定量資料采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。
　

7、　 結(jié)果:
　　 1．在NCE組中，無一例出現(xiàn)Runx3基因啟動子區(qū)域的甲基化，而在PTC組中，有35.7％(20/56)出現(xiàn)甲基化，兩組之間有顯著性差異(P＜0.05)。Runx3基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)與PTC患者的TNM分期、病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜o(jì)．05)；而與患者的性別、年齡及腫瘤大小無關(guān)(P＞0.05)。
　　 2．在NCE組中，均可見Runx3基因mRNA的轉(zhuǎn)錄，而在PTC組中，有57.1％(3

8、2/56)出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄缺失或下調(diào)，兩組之間有顯著性差異(P＜0.05)。Runx3基因mRNA的轉(zhuǎn)錄與PTC患者的病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)；而與患者的性別、TNM分期、年齡及腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05）。
　　 3.56例NCE組中，均可見Runx3蛋白表達(dá)，而在PTC組中，有60.7％(34/56)出現(xiàn)表達(dá)缺失或下調(diào)，兩組之間有顯著性差異(P＜0.05)。Runx3基因mRNA的轉(zhuǎn)錄與PTC患者的TNM分期、病理分

9、級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)；而與患者的性別、年齡及腫瘤大小無關(guān)(P＞0.05)。
　　 4.56例PTC中，Runx3基因啟動子甲基化陽性大多伴隨Runx3蛋白陰性，兩者有明顯的負(fù)相關(guān)性(P＜0.05)；Runx3基因mRNA轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)大多具有一致性(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1．Runx3基因在甲狀腺乳頭狀癌中存在明顯的表達(dá)缺失或下調(diào)，在癌旁組織中表達(dá)正常。并且Runx3基因的表達(dá)失活與