甲狀腺乳頭狀癌組織中Smad4基因表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化相關(guān)性研究.pdf

1、目的:探查Smad4基因在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化情況，探討Smad4基因表達(dá)異常與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其生物學(xué)意義。
　　材料與方法:
　　1、材料:選自臺州學(xué)院附屬臺州市立醫(yī)院腫瘤外科2013年1月至2013年8月期間收治甲狀腺乳頭狀癌手術(shù)病例標(biāo)本共40例，分為賣驗(yàn)組和對照組。其中實(shí)驗(yàn)組甲狀腺乳頭狀癌20例，男性3例，女性17例，年齡21-59歲，平均44.6歲，根據(jù)患者性別、年齡、腫瘤大小、

2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期等因素分為亞組。實(shí)驗(yàn)組20例病例中，其中年齡≥45歲14例，＜45歲6例;腫瘤直徑＞1cm的17例，腫瘤直徑≤1cm的3例;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例。對照組為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫手術(shù)中腺腫周圍大體觀相對正常組織標(biāo)本，其中男性5例，女性15例，年齡23-65歲，平均42.3歲。所取40例標(biāo)本組織體積約6×6mm大小，其中1/2置于4％福爾馬林溶液中固定，用于免疫組織化學(xué)檢測;另1/2置-80℃低溫冰箱中保存，

3、用于Real-timePCR、蛋白質(zhì)印跡及甲基化特異性PCR檢測Smad4基因的表達(dá)。所有標(biāo)本組織選取均經(jīng)患者同意，術(shù)前未行放療或化療治療，術(shù)后病理證實(shí)。
　　2、方法
　　2.1 Immunohistochemistry(免疫組織化學(xué)，IHC):檢測Smad4蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織及正常甲狀腺組織中的表達(dá);檢測TGF-β1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織及正常甲狀腺組織中的表達(dá);數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用卡方檢驗(yàn)比較組間計(jì)數(shù)資料，P＜0.05時(shí)

4、認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.2 Real-time PCR(實(shí)時(shí)定量PCR):檢測Smad4基因mRNA在甲狀腺乳頭狀癌及對照組組中的表達(dá)情況并進(jìn)行對比分析，組間計(jì)數(shù)資料比較使用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.3 Western-blot（蛋白質(zhì)印跡法）:檢測Smad4蛋白在甲狀腺乳頭狀癌和正常甲狀腺組織中的表達(dá)情況，組間采用t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.4 MSP(甲基

5、化特異性PCR):檢測甲狀腺乳頭狀癌和對照組組織中Smad4基因的啟動(dòng)子甲基化情況并進(jìn)行對比分析，組間計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、Immunohistochemistry(IHC):20例甲狀腺乳頭狀癌組織中有7例Smad4蛋白表達(dá)呈陽性，對照組20例標(biāo)本中其中18例Smad4蛋白表達(dá)呈陽性，卡方檢驗(yàn)比較兩組數(shù)據(jù)，P=0.0010，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); TG

6、F-β1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中陽性表達(dá)率為85.0％(17/20)，而在對照組中的陽性表達(dá)率為50.0％(10/20)，組間計(jì)數(shù)使用卡方檢驗(yàn)，P=0.0428，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。比較腫瘤組中Smad4蛋白在年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等亞組間的表達(dá)，用Fisher's Exact方法檢驗(yàn)，P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、Real-time PCR:采用相對定量2-△△Ct方法處理Smad4基因mRNA

7、在甲狀腺乳頭狀癌組織和正常甲狀腺組織中的表達(dá)結(jié)果，結(jié)果顯示Smad4基因在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)平均為對照組的0.3476±0.0061，呈抑癌作用。
　　3、Western-blot:每個(gè)標(biāo)本組織重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次以上，用Imag J軟件測定條帶灰度值，結(jié)果顯示甲狀腺乳頭狀癌中Smad4蛋白條帶平均灰度值為0.3523±0.0121，正常對照組中Smad4蛋白條帶平均灰度值為0.7218±0.0067，Smad4蛋白在甲狀腺乳頭狀

8、癌組織中表達(dá)較對照組中表達(dá)低。
　　4、甲基化特異性PCR:20例甲狀腺乳頭狀癌組織中Smad4基因啟動(dòng)子甲基化率為35％(7/20)，對照組基因啟動(dòng)子甲基化率為5％(1/20)，組間計(jì)數(shù)用卡方檢驗(yàn)比較，P=0.0481，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、免疫組織化學(xué)、Western-blot結(jié)果提示:Smad4蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)下調(diào);Real-time PCR結(jié)果提示:Smad4基因mRNA在甲狀腺乳