卵巢癌TGFBI啟動(dòng)子甲基化與卵巢癌耐藥的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景：
　　 卵巢癌（上皮性癌）是當(dāng)前病死率最高的婦科惡性腫瘤之一。近年來(lái)卵巢癌的治療有了長(zhǎng)足發(fā)展，在滿意的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)基礎(chǔ)上輔以鉑類和紫杉醇為主的聯(lián)合化療的治療策略雖然改善了初治卵巢癌的預(yù)后，但其總體生存率仍無(wú)明顯改善，晚期卵巢癌5年生存率仍徘徊在30％左右。究其根源，腫瘤原發(fā)或化療后的獲得性耐藥是治療失敗的主要原因之一。因此，逆轉(zhuǎn)耐藥對(duì)提高患者生存率、改善預(yù)后有著重要的臨床意義。
　　 腫瘤的耐藥與多種因素相關(guān)

2、，如腫瘤基因的擴(kuò)增、易位、缺失或突變等，而表觀遺傳學(xué)同樣在化療耐藥形成的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。作為表觀遺傳的重要機(jī)制之一，基因啟動(dòng)子中CpG島的甲基化是細(xì)胞中必不可少的一種修飾方式，是目前最為前沿及研究最多的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。腫瘤細(xì)胞中甲基化狀態(tài)的改變可以引起整體甲基化狀態(tài)降低亦或局部甲基化程度增高，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)于化療藥物的敏感性。一些相關(guān)基因如促藥物外排基因啟動(dòng)子甲基化程度的降低可誘導(dǎo)耐藥的產(chǎn)生，而由抑癌基因啟動(dòng)子的過(guò)度甲基化所致

3、的基因沉默(genesilencing)則可最終導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。
　　 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)基因（transforming growth factor β induced gene，TGFBI），又被稱為βig-H3基因(TGF-βinduce gene，colone3，βig-H3)，最早是在TGF-β刺激的肺腺癌細(xì)胞株A549中克隆得到的。作為細(xì)胞外基質(zhì)分子之一的TGFBI，最先被關(guān)注的是其調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和遷移的功能。隨著研究

4、的深入人們發(fā)現(xiàn)，TGFBI在正常細(xì)胞或永生化細(xì)胞系中表達(dá)水平上調(diào)，但在許多腫瘤組織中表現(xiàn)為表達(dá)水平下降或表達(dá)沉默，自此開始了對(duì)其作為腫瘤抑制基因的功能研究。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)在肺癌和前列腺癌等多種腫瘤中都存在TGFBI的啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，此外最新的研究顯示，在卵巢癌中也檢測(cè)到了TGFBI啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化。目前還未有研究就TGFBI基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化狀態(tài)是否與卵巢癌化療耐藥相關(guān)進(jìn)行過(guò)探討，鑒于此，本課題擬通過(guò)檢測(cè)卵巢癌組織及細(xì)胞系中T

5、GFBI的甲基化程度及表達(dá)水平，對(duì)照卵巢癌耐藥細(xì)胞系及其對(duì)應(yīng)敏感株中TGFBI甲基化狀態(tài)及表達(dá)水平的不同，探討卵巢癌中TGFBI甲基化狀態(tài)與腫瘤耐藥的相關(guān)性。
　　 第一部分：TGFBI在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及其甲基化狀態(tài)的檢測(cè)
　　 目的:檢測(cè)上皮性卵巢癌、良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中TGFBI啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)及其mRNA、蛋白表達(dá)情況，分析TGFBI異常甲基化與其表達(dá)的相關(guān)性及其與卵巢癌臨床分期、組織分級(jí)、病

6、理類型等特征間的關(guān)系，初步探討TGFBI啟動(dòng)子區(qū)甲基化在卵巢癌分子發(fā)病中的作用。
　　 方法:本研究采用RT-PCR及免疫組化方法檢測(cè)正常卵巢、良性卵巢腫瘤及卵巢癌組織中TGFBI的表達(dá)情況，并通過(guò)甲基化特異性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)及亞硫酸氫鹽基因組測(cè)序法(Bisufite genomic sequencing，BGS)檢測(cè)不同組織中TGFBI啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)。
　　 結(jié)果

7、:1.在全部正常卵巢及良性卵巢腫瘤組織中均檢測(cè)到TGFBImRNA表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為100％(10/10)，而在卵巢癌組織中TGFBI的表達(dá)率明顯下降，僅為30％(12/40)。卵巢癌組織與正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織中TGFBI表達(dá)存在顯著差異(x2=3.9474，p＜0.05)。
　　 2.10例正常卵巢組織及10例良性卵巢腫瘤組織中，均檢測(cè)到TGFBI蛋白表達(dá)，且均呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性（2+或3+），相反，在40例卵巢癌組織中，T

8、GFBI蛋白表達(dá)缺如或呈現(xiàn)低表達(dá)（0或1+）。卵巢癌組織中TGFBI蛋白表達(dá)水平與正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織間存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=50，p＜0.01）。
　　 3.卵巢癌組織中72.5％(29/40)的組織存在TGFBI甲基化，卵巢良性腫瘤中僅10％(1/10)檢測(cè)到TGFBI基因甲基化，而在正常卵巢組織卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，三組之間差異顯著(x2=24.5，p＜0.01)。
　　 4.TGFBI啟動(dòng)子區(qū)甲基化陰

9、性的組織其表達(dá)率較高，為90.91％(10/11)，而存在啟動(dòng)子區(qū)甲基化的組織中表達(dá)率僅為6.90％(2/29)，其間表達(dá)存在顯著性差異(x2=7.8108，p＜0.01)。
　　 5.TGFBI啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度與這些臨床病理特征均無(wú)明顯相關(guān)性，但隨著手術(shù)病理分期的進(jìn)展以及組織病理學(xué)分級(jí)的增高，TGFBI的甲基化程度有明顯升高的趨勢(shì)。
　　 結(jié)論:TGFBI在上皮性卵巢癌組織中低表達(dá)或表達(dá)缺失。TGFBI啟動(dòng)子區(qū)Cp

10、G島的高甲基化是上皮性卵巢癌中的頻發(fā)事件，它是卵巢癌中TGFBI低表達(dá)或表達(dá)缺失的重要原因，在卵巢癌的發(fā)生過(guò)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。TGFBI的高甲基化可作為表觀遺傳學(xué)標(biāo)記物。
　　 第二部分：TGFBI啟動(dòng)子區(qū)甲基化與卵巢癌化療耐藥的相關(guān)性研究
　　 目的:擬通過(guò)MSP及BGS方法聯(lián)合檢測(cè)卵巢癌紫杉醇敏感株及耐藥株中TGFBI啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，應(yīng)用去甲基化試劑5-aza-dc作用于細(xì)胞系，分析去甲基化作用前后TGFBI

11、表達(dá)水平的改變，以及對(duì)細(xì)胞增殖的影響，初步分析TGFBI甲基化狀態(tài)與上皮性卵巢癌化療耐藥的相關(guān)性，討論卵巢癌耐藥的可能機(jī)制及其治療策略。
　　 方法:本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western Blotting方法檢測(cè)去甲基化藥物作用前后TGFBI表達(dá);MSP及BGS法聯(lián)合檢測(cè)6種上皮性卵巢癌細(xì)胞系中TGFBI啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài);MTT法檢測(cè)去甲基化藥物作用前后的細(xì)胞增殖及遷移能力的改變。
　　 結(jié)果:1.紫杉醇耐藥株

12、SKOV3/TR和A2780/TR表現(xiàn)為完全甲基化狀態(tài)(M)，其余細(xì)胞株則表現(xiàn)為混合甲基化狀態(tài)(M+U)。敏感株與對(duì)應(yīng)耐藥株間的甲基化率檢測(cè)差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SKOV3/TR(94.3％)與SKOV3(42.9％)(x2=64.43,p＜0.01),A2780/TR(91.4％)及A2780(35.2％)(x2=71.38,p＜0.01)。
　　 2.紫杉醇耐藥細(xì)胞株中TGFBI呈完全甲基化狀態(tài)，去甲基化藥物可以使其部分

13、至全部去甲基化。去甲基化藥物作用后TGFBI在紫杉醇耐藥細(xì)胞中表達(dá)顯著增高，SKOV3/TR（7.8±0.9vs.0，P＜0.001）以及A2780/TR(6.4±0.2vs.0，P＜0.001);而在其它細(xì)胞系中用藥后雖有表達(dá)升高，但無(wú)顯著差異。WesternBlotting方法對(duì)兩對(duì)敏感株及耐藥株用藥前后的TGFBI蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果與其mRNA表達(dá)相吻合。
　　 3.10mmol/L5-aza-dc處理96h后，紫杉

14、醇耐藥株SKOV3/TR及A2780不同濃度紫杉醇(0.01、0.1、1、10μM)處理下的抑制率均高于對(duì)照組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SKOV3/TR(0.19±0.01μMvs.0.42±0.02μM，P=0.001)及A2780(0.012±0.0001μMvs.0.33±0.011μM，P=0.001)的IC50值均較對(duì)照組有顯著差異。
　　 結(jié)論:卵巢癌細(xì)胞系中均檢測(cè)出TGFBI啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，應(yīng)用去甲基化藥物5-a