RASSF2A基因在卵巢癌中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)及其啟動子甲基化狀態(tài)的研究.pdf

1、研究背景:
　　卵巢癌是女性系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其中上皮性卵巢癌是最常見的組織學(xué)類型，占卵巢惡性腫瘤的85％-90％。由于卵巢位于盆腔深部，發(fā)病隱匿，早期癥狀不典型，缺乏有效的早期診斷方法，臨床初診患者70-80％已屬中晚期。近年來，雖然腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和各種化療方法有了迅速發(fā)展，但其5年生存率無明顯改善，仍徘徊在30-40％，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅婦女健康的主要腫瘤，死亡率居婦科惡性腫瘤首位。因此，研究卵巢癌發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制，從分

2、子水平揭示上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程，研發(fā)早期診斷技術(shù)以及探索新的藥物治療靶點是目前的研究熱點。
　　近年來，隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，人們逐步認(rèn)識到表觀遺傳學(xué)的改變和遺傳學(xué)的改變一樣共同參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，腫瘤不僅是遺傳學(xué)疾病，同時也是表觀遺傳學(xué)疾病。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的主要修飾形式，是在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，甲基被動的增添在胞嘧啶上，生成5-甲基胞嘧啶的過程，是目前表觀遺傳學(xué)中研究最多、最深入的領(lǐng)域。DNA的異常甲基化

3、和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而且是腫瘤中的早期、頻發(fā)事件。研究證實基因啟動子區(qū)高甲基化是腫瘤抑制基因失活的重要機(jī)制，在某些情況下甚至是抑癌基因失活的唯一機(jī)制。
　　惡性腫瘤患者外周血中游離DNA含量明顯高于正常健康人，而且具備與原發(fā)腫瘤組織一致的惡性細(xì)胞生物學(xué)行為，因此分析外周血中游離DNA的甲基化狀態(tài)，可以反映實體腫瘤的甲基化水平，對于惡性腫瘤的早期診斷極具臨床應(yīng)用價值，可作為一種潛在的無創(chuàng)性腫瘤標(biāo)志物。
　　DNA甲基化具

4、有可逆性，甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑可以逆轉(zhuǎn)抑癌基因的高甲基化狀態(tài)，使之重新表達(dá)，從而達(dá)到抑制腫瘤生長的目的，是目前腫瘤基因治療的研究熱點。5-氮雜2'-脫氧胞苷(5-aza-dC)是目前最為常見的核苷類甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長及侵襲。
　　Ras通過和不同的效應(yīng)分子結(jié)合來調(diào)節(jié)不同的生命活動，既能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，又能抑制生長，如促進(jìn)凋亡，細(xì)胞周期阻滯等。Ras的負(fù)效應(yīng)調(diào)節(jié)因子參與了Ras的生長抑制作用，其中研究最多的是R

5、ASSF家族。目前為止，共發(fā)現(xiàn)這個家族有10個成員(RASSF1-10)。大量研究已證實RASSF1A啟動子區(qū)超甲基化介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄失活是腫瘤癌變過程中的頻發(fā)事件，其參與了包括卵巢癌在內(nèi)的多種實性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，是上皮性卵巢癌中最常見的甲基化抑癌基因，可作為卵巢癌診治過程中有意義的分子生物學(xué)指標(biāo)。與RASSF1A具有高度同源性的RASSF2A在結(jié)直腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌中表達(dá)降低或缺失與其甲基化有關(guān)。RASSF2A基因作為

6、Ras的下游效應(yīng)物，在Ras激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，扮演抑癌基因的角色。但有關(guān)RASSF2A基因與卵巢癌的關(guān)系尚無文獻(xiàn)報道。
　　本實驗采用甲基化特異性PCR檢測上皮性卵巢癌組織及其相對應(yīng)的血清標(biāo)本中RASSF2A基因啟動子甲基化狀態(tài)，RT-PCR檢測RASSF2A mRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)情況，分析RASSF2A啟動子異常甲基化與其轉(zhuǎn)錄表達(dá)的相關(guān)性，甲基化狀態(tài)在兩種組織標(biāo)本中的相關(guān)性，以及RASSF2A啟動

7、子甲基化與卵巢癌患者臨床病理特征（年齡、病理類型、臨床分期、組織分級、淋巴轉(zhuǎn)移）的關(guān)系。并使用去甲基化試劑5-aza-dC作用于卵巢癌細(xì)胞系SKOV3，分析去甲基化作用前后RASSF2A表達(dá)水平、甲基化狀態(tài)的改變，以及對細(xì)胞生物學(xué)活性的影響，探討RASSF2A啟動子區(qū)甲基化在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制，血清RASSF2A啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)在卵巢癌早期診斷中的價值，初步探索并尋找治療卵巢癌的新靶點。
　　第一部分卵巢癌組織中RAS

8、SF2A基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)及其甲基化狀態(tài)的檢測
　　目的:
　　檢測上皮性卵巢癌、良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中RASSF2A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及其mRNA表達(dá)情況，分析RASSF2A基因啟動子異常甲基化與轉(zhuǎn)錄表達(dá)的相關(guān)性，及其與卵巢癌患者年齡、病理類型、臨床分期、組織分級、淋巴轉(zhuǎn)移等臨床病理特征的關(guān)系，初步探討RASSF2A基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化水平與其表達(dá)缺失之間的關(guān)系，研究RASSF2A基因在上皮性卵巢癌中的作用機(jī)制

9、。
　　方法:
　　本研究采用RT-PCR方法檢測上皮性卵巢癌、良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中RASSF2A基因mRNA表達(dá)情況，同時采用甲基化特異性PCR(Methylation-specific PCR，MSP)方法檢測不同組織中RASSF2A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果:
　　1.RASSF2A mRNA在三組卵巢組織中的表達(dá)RASSF2A mRNA在正常卵巢及良性卵巢腫瘤組織中的陽性表達(dá)率分別為90％

10、(9/10)、85.7％(12/14)，而在卵巢癌組織中RASSF2A的表達(dá)率明顯下降，僅為42.6％(20/47)。三組中RASSF2AmRNA的表達(dá)存在顯著性差異(x2=13.198，p=0.001)。三組中兩兩比較，卵巢癌組與良性卵巢腫瘤組，卵巢癌組與正常卵巢組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=8.057，p=0.005; x2=7.427，p=0.006)，良性卵巢腫瘤組與正常卵巢組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(x2=0.098，p=0.75

11、4)。
　　2.三組卵巢組織中RASSF2A基因啟動子甲基化狀態(tài)卵巢癌組織中有51.1％(24/47)的組織存在RASSF2A甲基化，而在良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中均未檢測到此現(xiàn)象。卵巢癌組織中RASSF2A甲基化陽性率明顯高于良性卵巢腫瘤、正常卵巢組織(x2=18.513，p=0.001)，差異具有顯著性。
　　3.RASSF2A啟動子甲基化與基因表達(dá)及卵巢癌的關(guān)系在卵巢癌組織中，RASSF2A甲基化陰性的組織中其mRN

12、A的表達(dá)率較高，為82.6％(19/23)，而在RASSF2A甲基化陽性的組織中其mRNA的表達(dá)明顯下降，僅為33.3％(8/24)，差異具有顯著性（x2=11.665，r=-0.498，p=0.001）。RASSF2A甲基化程度與卵巢癌患者的年齡、病理類型、臨床分期、組織分級、淋巴轉(zhuǎn)移之間無明顯的相關(guān)性。但隨著患者年齡的增加，RASSF2A甲基化有升高趨勢。
　　結(jié)論:
　　1.RASSF2A mRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)

13、明顯低于正常卵巢和良性卵巢腫瘤組織，呈低表達(dá)或表達(dá)缺失。
　　2.RASSF2A啟動子區(qū)高甲基化是卵巢癌中的頻發(fā)事件，是卵巢癌中作為抑癌基因的RASSF2A失活的重要原因之一。
　　3.RASSF2A啟動子區(qū)高甲基化導(dǎo)致的基因轉(zhuǎn)錄沉默在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分卵巢癌患者血清標(biāo)本中RASSF2A基因甲基化水平及臨床意義
　　目的:
　　檢測上皮性卵巢癌、良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織相配對的

14、血清標(biāo)本中RASSF2A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，并分析其與卵巢癌患者年齡、病理類型、臨床分期、組織分級、淋巴轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)的關(guān)系，初步探討檢測血清RASSF2A啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)在卵巢癌診斷中的作用。
　　方法:
　　本研究采用MSP方法檢測第一部分實驗中卵巢組織相對應(yīng)的血清標(biāo)本中RASSF2A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果:
　　1.三組血清標(biāo)本中RASSF2A啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)卵巢癌組血清中36.2％

15、(17/47)的標(biāo)本存在RASSF2A甲基化，而在良性卵巢腫瘤組及正常卵巢組中均未檢測到此現(xiàn)象。卵巢癌組血清標(biāo)本RASSF2A甲基化陽性率明顯高于良性卵巢腫瘤組、正常卵巢組(x2=11.414，p=0.003)，差異具有顯著性。
　　2.RASSF2A啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)在血清標(biāo)本與組織標(biāo)本中的關(guān)系結(jié)合第一部分實驗結(jié)果，在發(fā)生RASSF2A甲基化的24例組織標(biāo)本中，其對應(yīng)的血清標(biāo)本中有17例亦發(fā)生了甲基化;在未發(fā)生基因甲基化的23例

16、組織標(biāo)本中，其對應(yīng)的血清標(biāo)本也未發(fā)現(xiàn)甲基化現(xiàn)象。兩者有明顯的相關(guān)性，差異具有顯著性(x2=25.524, r=0.737, p=0.000)。
　　3.血清標(biāo)本中RASSF2A甲基化水平與臨床特征的關(guān)系血清標(biāo)本中RASSF2A甲基化程度與卵巢癌患者的臨床病理特征之間無明顯的相關(guān)性。
　　結(jié)論:
　　1.血清標(biāo)本中RASSF2A啟動子區(qū)甲基化具有腫瘤特異性，是卵巢癌中的早期、頻發(fā)事件。
　　2.血清標(biāo)本中RASSF

17、2A啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)可以間接反應(yīng)原發(fā)腫瘤DNA甲基化水平，是原發(fā)腫瘤的有效參考指標(biāo)。
　　3.檢測血清標(biāo)本中RASSF2A啟動子區(qū)甲基化水平可作為卵巢癌的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記物，有助于卵巢癌的早期診斷。
　　第三部分5-aza-dC對卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中RASSF2A基因甲基化及其表達(dá)的影響
　　目的:
　　本研究使用去甲基化試劑5-aza-dC作用于卵巢癌細(xì)胞系SKOV3，分析去甲基化作用前后RASSF2A基因

18、甲基化及其表達(dá)水平的改變，以及SKOV3細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，初步探討并尋找治療卵巢癌的新靶點。
　　方法:
　　本研究采用RT-PCR方法檢測5-aza-dC作用前后卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中RASSF2A mRNA表達(dá)水平;MSP方法檢測其甲基化狀態(tài)的改變;MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測藥物對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　結(jié)果:
　　1.去甲基化試劑對SKOV3中RASSF2A基因表達(dá)的影響5-aza-dC作用后使

19、卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中RASSF2A mRNA表達(dá)水平明顯增高。
　　2.去甲基化試劑對SKOV3中RASSF2A啟動子甲基化的影響5-aza-dC作用后使卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中RASSF2A基因甲基化水平下降。
　　3.去甲基化試劑對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響5-aza-dC藥物干預(yù)后，SKOV3細(xì)胞活性和抗凋亡能力均明顯下降。
　　結(jié)論:
　　1.去甲基化試劑5-aza-dC可使RASSF2A表達(dá)升高或重