上皮性卵巢癌多腫瘤抑制基因異常甲基化的研究.pdf

1、上皮性卵巢癌的發(fā)生是表遺傳學與遺傳學機制共同參與的涉及多基因改變、通過多階段變異累積形成的病理過程。目前，在其發(fā)生機制中，DNA 啟動子區(qū)CpG 島異常甲基化是一個研究熱點。表遺傳學是研究沒有 DNA 序列變化、可遺傳的基因表達的改變，表遺傳學的分子機制包括 DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質改型和RNA干涉等，它們在基因轉錄調控過程中起重要作用。作為表遺傳學機制的重要內容，DNA 甲基化是基因突變及缺失之外腫瘤抑制基因失活的第三種機制

2、，DNA 甲基化異常在多種腫瘤的發(fā)生中起重要作用。已有研究表明，腫瘤中異常甲基化的基因包括參與細胞周期調控、細胞分化、凋亡調控及腫瘤轉移和血管生成相關基因等。DNA 甲基化和組蛋白乙?；潜磉z傳學調控基因表達的兩種主要方式，DNA 低甲基化和組蛋白乙?；纱龠M基因表達，DNA 高甲基化和組蛋白去乙?；梢种苹虮磉_，DNA 甲基化和組蛋白乙?；嗷ビ绊?。 卵巢惡性腫瘤是女性生殖器三大惡性腫瘤之一，上皮性卵巢癌占卵巢惡性腫瘤85％

3、-90％，DNA 甲基化在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。若干腫瘤抑制基因啟動子區(qū)異常甲基化與上皮性卵巢癌的形成密切相關，研究表明，DNA甲基化酶抑制劑及組蛋白脫乙酰基酶抑制劑可能用于惡性腫瘤的臨床治療，包括上皮性卵巢癌在內。對腫瘤抑制基因啟動子區(qū)異常甲基化的深入研究不僅有助于揭示上皮性卵巢癌的發(fā)生機制，而且可能促進上皮性卵巢癌臨床診斷和治療的發(fā)展。 本研究旨在探討上皮性卵巢癌與表遺傳學的關系，選擇與細胞凋亡、細胞周期調控

4、、DNA 修復及化療耐藥相關的基因 RASSF1A、BRCA1、p16、hMLH1發(fā) MGMT，研究的第一部分首先通過檢測基因啟動子區(qū) CpG 島甲基化狀態(tài)及其蛋白表達，尋找上皮性卵巢癌相關的異常甲基化基因，進一步分析基因蛋白表達及與啟動子區(qū)甲基化的相關性，及與臨床病理學特征的關系。研究的第二部分從與遺傳學發(fā)生機制相結合的角度，分析上皮性卵巢癌組織中 MSI 狀態(tài)，以及上述抑癌基因啟動子甲基化及蛋白表達與MSI之間的相關性，探討 MMR

5、 基因hMLH1啟動子甲基化與 MSI 的相關性以及在上皮性卵巢癌發(fā)生及發(fā)展中的作用。研究的第三部分以前兩部分的實驗結果為基礎，選擇甲基化酶抑制劑 5-Aza-CdR 及脫乙酰基酶抑制劑NaB兩種藥物，在觀察卵巢癌細胞系生長抑制的同時，分析五個抑癌基因啟動子區(qū) CpG 島甲基化狀態(tài)、mRNA 及蛋白表達的改變，探討藥物調控的意義及潛在的臨床應用價值。材料與方法一、實驗材料中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦科、遼寧省腫瘤醫(yī)院婦科 1999-200

6、6 年手術治療63例原發(fā)散發(fā)性上皮性卵巢癌組織、41 例相應的盆腹腔轉移灶、10 例癌旁卵巢組織及 20 例正常卵巢組織；上皮性卵巢癌細胞株：CAOV3 及 OVCaR3(中國醫(yī)科大學細胞生物教研室)，HO-8910(上海腫瘤細胞研究所)，A2780(天津血液病學研究所)； RNA 提取試劑 TRIZOL Reagent(GIBCO BRL 公司)，甲基化酶抑制劑 5-aza-2’-deoxycitydine(5-Aza-CdR)及脫乙

7、?；敢种苿?Sodium Butyrate(NaB)(Sigma)，RT-PCR試劑盒(TaKaRa)，Wizard DNA Clean-up(Promega 公司)，Annexin-v-FITC 凋亡檢測試劑盒(北京寶賽生物技術有限公司)，RASSF1A 羊抗人多克隆抗體、BRCA1 兔抗人多克隆抗體、P16 鼠抗人單克隆抗體(Santa cruz)，hMLH1 兔抗人單克隆抗體及 MGMT 鼠抗人單克隆抗體(Neomarkers)