食管鱗癌中RUNX3基因啟動子高甲基化及其表達(dá)失活的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，占惡性腫瘤發(fā)病率的第6位，死亡率為第4位，在亞洲國家中食管鱗癌占90％。目前，對食管癌的癌變機(jī)制研究取得了一定的進(jìn)展，但具體分子機(jī)理仍不清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn)某些腫瘤抑制基因其DNA序列完整，并未有突變、缺失等變化，用經(jīng)典的遺傳調(diào)控理論難以解釋抑癌基因失活的現(xiàn)象，逐漸認(rèn)識到Epigentics(表觀遺傳學(xué))參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，主要包括DNA甲基化和組蛋白去乙?；渲蠨NA甲基化是表觀遺傳調(diào)控的重要方式。

2、近年來研究遍認(rèn)為DNA甲基化是腫瘤抑制基因失活的主要原因，是抑癌基因失活的第三條途徑，在某些情況下甚至可能為調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的唯一的機(jī)制。最近研究發(fā)現(xiàn)RUNX3是一個(gè)新的候選抑癌基因，在人類腫瘤細(xì)胞系或腫瘤組織如胃癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)或缺失，而RUNX3基因啟動子區(qū)高甲基化是導(dǎo)致RUNX3表達(dá)失活的主要原因之一，但在食管鱗癌中RUNX3基因啟動子甲基化及其轉(zhuǎn)錄表達(dá)狀況國內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)道。從比較基因組學(xué)研究來看，食管鱗癌存

3、在1p36.1位點(diǎn)的高頻率雜合性缺失(LOH)，由于RUNX3基因正好位于1p36.1位點(diǎn)，因此食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展很可能涉及到RUNX3基因的表達(dá)改變。為此，我們第一部分運(yùn)用半定量RT-PCR、Western blotting方法分別從mRNA及蛋白水平檢測RUNX3基因在食管鱗癌中表達(dá)情況，并分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，評判RUNX3基因是否是食管鱗癌的候選抑癌基因；第二部分首先運(yùn)用MSP技術(shù)從DNA水平檢測RUNX3基因啟動子甲基化

4、狀況，探討RUNX3基因在食管鱗癌中表達(dá)失活的可能機(jī)制；然后采用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜胞苷(5-azaC)對食管鱗癌Eca109細(xì)胞株進(jìn)行干預(yù)，探討5-azaC對Eca109細(xì)胞株生長增殖及其RUNX3基因表達(dá)的影響，以期進(jìn)一步探討食管鱗癌中RUNX3基因表達(dá)失活的機(jī)制并尋找腫瘤治療的新靶點(diǎn)。 第一部分食管鱗癌中RUNX3基因表達(dá)失活及臨床意義的研究 目的：探討RUNX3在食管鱗癌中的表達(dá)情況及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，

5、評判RUNX3基因是否是食管鱗癌的候選抑癌基因。 方法：采用半定量RT-PCR、Western blotting方法分別從mRNA及蛋白水平檢測RUNX3基因在Ecal09細(xì)胞株、42例食管鱗癌組織及癌旁正常組織中表達(dá)的差異、并分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系等。 結(jié)果：RT-PCR顯示RUNX3 mRNA在Eca109細(xì)胞株中表達(dá)缺失，在54.8％(23/42)的食管鱗癌組織中表達(dá)缺失或明顯下調(diào)，而在42例癌旁正常組織中正常

6、表達(dá)，RUNX3 mRNA在癌組織與癌旁正常組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。RUNX3 mRNA的表達(dá)缺失或下調(diào)與食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)(p值均小于0.05)，與性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、飲酒史、家族史等之間無明顯相關(guān)(P>0.05)。Western blotting顯示Eca109細(xì)胞株及47.6％(20/42)食管鱗癌組織RUNX3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)或缺失，而在癌旁正常組織中表達(dá)正常，RUN

7、X3蛋白在癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，RUNX3蛋白的表達(dá)下調(diào)或缺失與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)(P值均小于0.05)，與性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、飲酒史、家族史等之間無明顯相關(guān)(P>0.05)。 結(jié)論：RUNX3基因在食管鱗癌組織及細(xì)胞株Eca109中存在明顯的表達(dá)缺失或下調(diào)，并與食管鱗癌TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，RUNX3是食管鱗癌的新型候選抑癌基因。 第二部分食管

8、鱗癌中RUNX3基因啟動子高甲基化及其去甲基化干預(yù)研究 第一節(jié)食管鱗癌中RUNX3基因啟動子高甲基化及臨床意義的研究 目的：檢測RUNX3基因啟動子甲基化狀況，探討RUNX3基因在食管鱗癌中表達(dá)失活的可能機(jī)制。 方法：采用MSP技術(shù)檢測42例食管鱗癌、癌旁正常組織及細(xì)胞株Eca109中RUNX3基因啟動子區(qū)甲基化狀況，并分析其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。 結(jié)果：MSP表明64.3％(27/42)的食管鱗癌組

9、織及Eca109細(xì)胞株中存在RUNX3啟動子區(qū)高甲基化，而相應(yīng)癌旁正常組織未見高甲基化，RUNX3啟動子甲基化率在癌及癌旁正常組織比較中有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，RUNX3啟動子高甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)(P值分別小于0.05和0.01)。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N<,0>)組RUNX3啟動子甲基化率為43.8％，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N<,1>)組為76.9％，二者相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P=0.029)。食管鱗癌TNM分期早期

10、(Ⅰ～Ⅱ期)RUNX3啟動子甲基化率為38.9％，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)為83.3％，二者相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.008)。27例RUNX3基因啟動子高甲基化食管鱗癌組織中有23例其mRNA表達(dá)缺失或降低，20例RUNX3蛋白表達(dá)下調(diào)，RUNX3啟動子高甲基化與mRNA及蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.82和-0.711，P<0.001)。 結(jié)論：RUNX3基因啟動子高甲基化是RUNX3表達(dá)失活的主要原因，在食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展中

11、起重要作用，RUNX3基因啟動子甲基化檢測可作為食管鱗癌預(yù)后評估的腫瘤標(biāo)志物。 第二節(jié)5-氮雜胞苷對Eca109細(xì)胞株生長增殖及其RUNX3基因表達(dá)影響的研究 目的：探討5-azaC干預(yù)對Eca109細(xì)胞株生長增殖及其抑癌基因RUNX3表達(dá)的影響，以期進(jìn)一步探討食管鱗癌中RUNX3基因表達(dá)失活的機(jī)制并尋找腫瘤治療的新靶點(diǎn)。 方法：應(yīng)用MTT法來觀察5-azaC對Eca109細(xì)胞生長增殖的抑制能力，摸索有效細(xì)胞干預(yù)

12、濃度；采用10μmol/L，20μmol/L，50μmol/L三種不同濃度的5-azaC處理Eca109細(xì)胞株，采用MSP檢測干預(yù)前后Eca109細(xì)胞中RUNX3基因啟動子區(qū)的甲基化狀況；應(yīng)用RT-PCR，Western blotting等方法檢測干預(yù)前后Eca109細(xì)胞中RUNX3基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化；流式細(xì)胞儀檢測干預(yù)前后細(xì)胞凋亡的變化。 結(jié)果：Eca109細(xì)胞RUNX3基因啟動子處于異常的高甲基化狀態(tài)，經(jīng)5-