食管鱗癌中FBXO32基因的表達(dá)及其甲基化狀態(tài)研究.pdf

1、目的:消化道惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的健康，我國是世界食管癌的高發(fā)國，尤其是河北的磁縣和涉縣是世界食管癌的高發(fā)區(qū)之一。食管癌因其癥狀的隱匿性極難早期發(fā)現(xiàn)，癥狀明顯時(shí)已是腫瘤的中晚期，因此預(yù)后較差。近年來對食管癌的病因已進(jìn)行廣泛研究，其中對表觀遺傳學(xué)的改變尤其是DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)。
　　 DNA甲基化是真核細(xì)胞DNA最普遍的修飾形式，同時(shí)是哺乳類動(dòng)物的一種復(fù)制后調(diào)節(jié)方式，DNA甲基化與基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。許多國內(nèi)外

2、的研究顯示基因啟動(dòng)子異常甲基化在許多腫瘤的發(fā)生過程中是一個(gè)頻發(fā)的早期事件，因此腫瘤相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)是腫瘤發(fā)生的一個(gè)早期敏感指標(biāo)，被認(rèn)為是有前景的腫瘤分子標(biāo)志物。本研究通過檢測食管癌細(xì)胞和食管鱗癌組織中肌肉萎縮相關(guān)基因1(FBXO32，又名atrogin-1，MAFbx)基因的mRNA和蛋白表達(dá)情況以及甲基化狀態(tài)，探討FBXO32基因在食管鱗癌中的表達(dá)及臨床意義。
　　 方法:
　　 1應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(rev

3、ersetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)技術(shù)分別檢測應(yīng)用DNA去甲基化劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-aza-2’-deoxycitydine，5-aza-dC）處理前后的食管癌細(xì)胞系(TE1、TE13、T.TN、Yes-2)和51例食管鱗癌組織及癌旁正常組織中FBXO32基因的mRNA表達(dá)情況。
　　 2應(yīng)用免疫細(xì)胞/組織化學(xué)（immunocytochemical/imm

4、unohistochemistry）SP法分別檢測應(yīng)用5-aza-dC處理前后的食管癌細(xì)胞系和51例食管鱗癌組織及癌旁正常組織中FBXO32蛋白的表達(dá)情況。
　　 3應(yīng)用甲基化特異性PCR(methylationspecificpolymerasechainreaction，MSP)技術(shù)分別檢測應(yīng)用5-aza-dC處理前后的食管癌細(xì)胞系和51例食管鱗癌組織及癌旁正常組織中FBXO32基因的甲基化狀態(tài)。
　　 4運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟

5、件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1食管癌細(xì)胞中FBXO32基因的表達(dá)及甲基化狀態(tài)情況
　　 1.15-aza-dC處理前后的食管癌細(xì)胞系中FBXO32的mRNA表達(dá)情況
　　 四株未處理的食管癌細(xì)胞株中，TE1細(xì)胞株中FBXO32基因mRNA表達(dá)陽性，TE13、T.TN、Yes-2細(xì)胞株中該基因mRNA表達(dá)缺失，經(jīng)5-aza-dC處理培養(yǎng)后，四種細(xì)胞株中均檢測出FBXO32m

6、RNA的表達(dá)。
　　 1.25-aza-dC處理前后的食管癌細(xì)胞中FBXO32基因蛋白表達(dá)情況
　　 TE1細(xì)胞株用5-aza-dC處理前蛋白表達(dá)陽性，TE13、T.TN、Yes-2細(xì)胞株5-aza-dC處理前FBXO32蛋白表達(dá)陰性，應(yīng)用甲基化抑制劑5-aza-dC處理后四種食管癌細(xì)胞株中FBXO32的蛋白表達(dá)均呈陽性，表明應(yīng)用5-aza-dC處理后FBXO32在食管癌細(xì)胞系中恢復(fù)表達(dá)。
　　 1.35-aza

7、-dC處理前后食管癌細(xì)胞系中FBXO32的甲基化狀態(tài)
　　 TE13、T.TN、Yes-2細(xì)胞株在5-aza-dC處理前表現(xiàn)為FBXO32基因高甲基化狀態(tài)，應(yīng)用甲基化抑制劑5-aza-dC處理后該三種細(xì)胞株中FBXO32基因均表現(xiàn)為非甲基化狀態(tài)。TE1細(xì)胞株在5-aza-dC處理前表現(xiàn)為不完全甲基化狀態(tài)，應(yīng)用甲基化抑制劑5-aza-dC處理后表現(xiàn)為非甲基化狀態(tài)。
　　 2食管癌組織中FBXO32基因的表達(dá)、甲基化狀態(tài)及其

8、與臨床病理資料之間的關(guān)系
　　 2.1食管癌組織中FBXO32基因mRNA表達(dá)情況
　　 FBXO32基因mRNA在食管癌和癌旁正常組織中的表達(dá)量分別為0.24±0.15和0.49±0.21，食管癌組織中FBXO32基因的mRNA表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織，兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在食管鱗癌患者中，F(xiàn)BXO32的mRNA表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及腫瘤組織分期和分化程度有關(guān)(P＜0.05)。
　　

9、 2.2食管癌組織中FBXO32基因蛋白表達(dá)情況
　　 51例食管鱗癌組織中，其中12例FBXO32基因蛋白表達(dá)陽性，陽性表達(dá)率為23.5％;正常食管黏膜組織51例，其中36例FBXO32基因蛋白表達(dá)陽性，陽性表達(dá)率為70.5％，正常食管黏膜組織FBXO32蛋白陽性表達(dá)率顯著高于食管癌組織(P＜0.01)。在食管鱗癌中，F(xiàn)BXO32蛋白表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)(P＜0.05)，而與腫瘤組織的分期和分化程度無關(guān)（P＞0.05

10、）。
　　 2.3食管癌組織中FBXO32基因甲基化狀態(tài)
　　 FBXO32基因啟動(dòng)子區(qū)在食管鱗癌組織和癌旁正常組織中的甲基化率分別為52.9％(27/51)和27.5％(14/51)，食管鱗癌組織中FBXO32基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率顯著高于癌旁正常組織(P=0.000)。低分化鱗癌組FBXO32基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率84.0％(21/25)顯著高于高中分化鱗癌組甲基化發(fā)生率23.1％(6/26)(P＜0.05);FBX

11、O32基因啟動(dòng)子區(qū)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的甲基化發(fā)生率80.8％(21/26)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的甲基化發(fā)生率24.0％(6/25)(P＜0.05);FBXO32基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率與腫瘤組織分期、年齡和性別無關(guān)(P＞0.05)。
　　 2.4FBXO32基因甲基化與其mRNA和蛋白表達(dá)的關(guān)系以及mRNA和蛋白表達(dá)之間的關(guān)系
　　 FBXO32蛋白表達(dá)陽性的食管鱗癌組織中，其mRNA相對表達(dá)量平均為0.33±0.19，F(xiàn)B

12、XO32蛋白表達(dá)陰性的食管鱗癌組織中，其mRNA相對表達(dá)量平均為0.21±0.13，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在FBXO32基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽性的食管鱗癌組織中，其mRNA相對表達(dá)量平均為0.19±0.12，甲基化陰性的食管鱗癌組織中mRNA相對表達(dá)量平均為0.30±0.17，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。發(fā)生FBXO32基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化的食管鱗癌組織中FBXO32蛋白表達(dá)陽性率為11.1％(3/27)，未發(fā)生

13、FBXO32基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化的食管鱗癌組織中FBXO32蛋白表達(dá)陽性率為37.5％(9/24)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1FBXO32基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化是其在食管癌細(xì)胞中表達(dá)缺失的重要機(jī)制之一，5-aza-dC能逆轉(zhuǎn)FBXO32基因的甲基化，恢復(fù)FBXO32的表達(dá)，為FBXO32作為食管癌去甲基化治療的靶標(biāo)提供了科學(xué)依據(jù)。
　　 2FBXO32啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況與患者年