非小細(xì)胞肺癌中抑癌基因的甲基化狀態(tài)與去甲基化效應(yīng)及mRNA表達(dá)變化的機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：肺癌包括非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)，是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率極高的惡性腫瘤之一，而DNA甲基化與肺癌的關(guān)系密切，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著極其重要的角色。DNA異常甲基化是可使腫瘤抑制基因(TSGs)發(fā)生沉默的新型相關(guān)研究機(jī)制。本研究的主要目的是對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和非小細(xì)胞肺癌臨床組織樣本進(jìn)行E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化狀態(tài)及其與mRNA表達(dá)之間關(guān)系的研究，探討E-cadher

2、in基因的DNA甲基化狀態(tài)與各種臨床病例因素之間的關(guān)系。分析3號(hào)染色體上8個(gè)抑癌基因在肺癌細(xì)胞株中的去甲基化效應(yīng)并探討其與CpG島甲基化表型(CpG island methylatorphenotype,CIMP)的關(guān)系，為肺癌的臨床早期診斷和預(yù)后、治療提供理論依據(jù)。 方法：利用通用引物進(jìn)行巢式PCR的方法對(duì)5株NSCLC細(xì)胞株和35例NSCLC組織及其相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化狀態(tài)分析

3、，再利用DNA測(cè)序檢測(cè)具體CpG島甲基化位點(diǎn)；同時(shí)采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Real-Time PCR)方法分析E-cadherin基因的mRNA表達(dá)水平；另外在5株NSCLC細(xì)胞株中對(duì)染色體3p上8個(gè)TSGs應(yīng)用甲基化特異性PCR(MSP)方法進(jìn)行CIMP分析，檢測(cè)甲基化抑制劑5-雜氮-2＇-脫氧胞甘酸(5-aza-CdR)處理細(xì)胞后甲基化狀態(tài)的變化；同時(shí)，利用MTT法分析腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。采用Real-TimePCR方法重點(diǎn)分析了h

4、OGGl基因mRNA表達(dá)的變化及其與CIMP的關(guān)系。 結(jié)果：測(cè)序結(jié)果表明E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域存在著19個(gè)CpG島甲基化位點(diǎn)，分別分布在翻譯起始位點(diǎn)上游-181，-176，-169，-160，-137，-119，-116，-89，-65，-55，-50，-45，-41，-35，-32，-22，-18，-15，-9處。另外我們發(fā)現(xiàn)在所有NSCLC細(xì)胞株中至少有一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生甲基化。在NSCLC組織樣本中E-cadheri

5、n基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化頻率為28.6％(10/35)，且甲基化位點(diǎn)在19個(gè)CpG島呈不同分布形態(tài)，在相應(yīng)癌旁組織中也出現(xiàn)34.3％(12/35)的高甲基化頻率；統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明E-cadherin基因甲基化狀態(tài)與非小細(xì)胞肺癌組織病理類型、年齡、性別及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間無(wú)顯著相關(guān)性。在癌組織中發(fā)生甲基化的10例樣本中有7例發(fā)生E-cadherin基因mRNA表達(dá)下調(diào)，而在未發(fā)生甲基化樣本中有16例發(fā)生甲基化下調(diào)：通過(guò)5-aza-CdR處理后

6、5株細(xì)胞株中有兩株甲基化狀態(tài)發(fā)生改變且其mRNA表達(dá)有上調(diào)，但并不明顯。這與NSCLC組織中的結(jié)果一致，證明E-cadherin基因mRNA表達(dá)可能與甲基化狀態(tài)無(wú)關(guān)，P=1.000。 另外在對(duì)5株非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的藥物處理組與空白對(duì)照組中分析3號(hào)染色體上8個(gè)抑癌基因VHL、RAR-b、RASSFlA、FHIT、hMLHl、BLU、SEMA3B及hOGGl基因的甲基化狀態(tài)和CIMP結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，CIMP結(jié)果都為陽(yáng)性。通過(guò)甲基化抑制

7、劑處理后，有3株CIMP結(jié)果由陽(yáng)性轉(zhuǎn)為陰性，細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生了變化，細(xì)胞發(fā)生凋亡，生長(zhǎng)受到抑制，并且MTT結(jié)果顯示加藥處理第6天時(shí)，這3株細(xì)胞生長(zhǎng)曲線都明顯下降；而另外兩株細(xì)胞則對(duì)藥物不敏感，且CIMP無(wú)明顯變化。令人感興趣的是，在我們所重點(diǎn)研究的新候選腫瘤抑制基因hOGGl基因中去甲基化作用相對(duì)來(lái)說(shuō)最明顯，因此我們選取hOGGl基因在5株非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的藥物處理組與空白對(duì)照組中檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除一株先前CIMP結(jié)果未

8、發(fā)生變化的細(xì)胞株外，其它4株mRNA表達(dá)均發(fā)生明顯上調(diào)，說(shuō)明hOGGl基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)與其mRNA表達(dá)顯著相關(guān)，并且證實(shí)了通過(guò)去甲基化藥物的實(shí)施可以使腫瘤抑制基因獲得重新表達(dá)，恢復(fù)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的功能。 結(jié)論：我們?cè)贜SCLC中發(fā)現(xiàn)E-cadherin基因啟動(dòng)子上游區(qū)域存在著19個(gè)特異甲基化位點(diǎn)，但發(fā)現(xiàn)癌和癌旁組織甲基化頻率相當(dāng)，無(wú)明顯差異，且E-cadherin基因甲基化狀態(tài)與臨床病理特征及mRNA表達(dá)均無(wú)關(guān)，說(shuō)明