KLF2基因甲基化狀態(tài)與非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)性及其功能的研究.pdf

1、肺癌仍是世界上致死性最高、最常見的惡性腫瘤之一，而非小細(xì)胞肺癌是其主要的類型（約80％）。肺癌每年的新增病例數(shù)為180萬，占腫瘤發(fā)病率的13％，已成為對(duì)國民健康造成嚴(yán)重威脅的疾病之一。目前，肺癌絕大多數(shù)病例在確診時(shí)已經(jīng)是晚期，這就意味著治療方案選擇的局限，從而預(yù)后較差且5年生存率低。因此，尋找肺癌的新型生物標(biāo)志物和更好地了解非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生可能在改善肺癌早期診斷，治療選擇和臨床預(yù)后等方面具有重要的意義。
　　最新的研究中已經(jīng)闡明

2、，大部分癌癥的發(fā)生是由于DNA在復(fù)制過程發(fā)生復(fù)制隨機(jī)錯(cuò)誤造成的，但是肺癌的發(fā)生發(fā)展仍是一個(gè)涉及了遺傳和環(huán)境因素等相互作用的多步過程，其中環(huán)境因素更被認(rèn)為是肺癌發(fā)生的主要原因。眾所周知，表觀遺傳學(xué)的改變與環(huán)境的作用密切相關(guān)，此外，表觀遺傳學(xué)的改變普遍是多于基因突變等先天遺傳改變的，而且這種變化大多是由于環(huán)境的影響造成的，因此它可以反映環(huán)境引起的病理變化。同時(shí)，腫瘤的發(fā)生也與表觀遺傳學(xué)的改變密不可分。腫瘤發(fā)生就是眾多表觀遺傳學(xué)改變疊加的結(jié)果

3、，這種表觀遺傳學(xué)改變的積累使得細(xì)胞基因表達(dá)水平發(fā)生變化，然后進(jìn)一步影響信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。DNA甲基化誘導(dǎo)基因的沉默就是一種較為常見的表觀遺傳調(diào)控模式。有研究證實(shí)在眾多的惡性腫瘤的癌前病變中，存在多個(gè)腫瘤抑制基因的CpG島高甲基化，證明甲基化狀態(tài)的改變?cè)诎┣安∽冸A段及腫瘤發(fā)生的早期階段就早已存在。作為腫瘤發(fā)生中的一個(gè)早期事件，基因CpG島的甲基化發(fā)生在相應(yīng)正常細(xì)胞形態(tài)及功能發(fā)生改變之前?？梢哉f，DNA甲基化可以通過表觀遺傳的方式

4、來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，而這一過程是動(dòng)態(tài)可逆的，這一樣來DNA甲基化狀態(tài)的改變就可以用于監(jiān)測(cè)基因的調(diào)節(jié)，并作為癌癥的早期診斷、預(yù)后和治療應(yīng)答的生物標(biāo)志物。
　　枯否樣因子2(KLF2)也被稱為肺枯否樣因子(LKLF)，在人肺部的晚期發(fā)育中起著重要的作用，這暗示KLF2的功能缺失也可能與肺部的病變相關(guān)。同時(shí)，KLF2基因在各種癌癥組織中通常都表達(dá)較低，它可以作為潛在的腫瘤抑制基因維持細(xì)胞的正?；?。因此，不難看出，KLF2的表達(dá)缺失可能是腫

5、瘤發(fā)生的驅(qū)動(dòng)因素之一。在對(duì)KLF2基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析后，我們發(fā)現(xiàn)在其基因序列上有一個(gè)含有267個(gè)CpG位點(diǎn)的CpG島，提示該基因的轉(zhuǎn)錄可能受到甲基化修飾的影響。因此，本研究將致力于探索KLF2 CpG島的甲基化改變?cè)诜切〖?xì)胞肺癌中是否參與了該基因的表達(dá)調(diào)控，為以后進(jìn)一步將KLF2甲基化狀態(tài)作為非小細(xì)胞肺癌的早期診斷標(biāo)志物提供線索。
　　方法:
　　1、使用熒光定量PCR技術(shù)分析KLF2基因在47對(duì)非小細(xì)胞肺癌組織和相應(yīng)正

6、常組織及6個(gè)細(xì)胞株中的表達(dá)情況。
　　2、使用重亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR技術(shù)(BSP)探索KLF2在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和正常支氣管細(xì)胞中的差異甲基化區(qū)域，然后用單克隆測(cè)序的方法進(jìn)一步驗(yàn)證該區(qū)域的甲基化情況。
　　3、利用去甲基化試劑5-氮雜-2-脫氧胞苷處理非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、HCC827，使用熒光定量PCR技術(shù)分析處理前后KLF2的表達(dá)情況。
　　4、使用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)KLF2基因區(qū)域4（+567至+

7、906）的功能和其甲基化后對(duì)基因表達(dá)的影響。
　　5、使用甲基化特異性PCR技術(shù)(MSP)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組織和相應(yīng)正常組織中KLF2基因的甲基化狀態(tài)。
　　6、使用CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲降或重新表達(dá)KLF2后非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的生存和克隆形成能力的變化。
　　7、使用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)來評(píng)估敲降或過表達(dá)KLF2后對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡情況的影響。
　　8、使用Western

8、蛋白印跡分析敲降或過表達(dá)KLF2后對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中p15和p21表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1、在47對(duì)非小細(xì)胞肺癌組織中，共有31對(duì)(65.96％)癌組織的KLF2表達(dá)水平比正常組織的低，且KLF2的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)。與正常支氣管細(xì)胞相比，KLF2在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)。
　　2、雖然KLF2基因啟動(dòng)子區(qū)域在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和正常支氣管細(xì)胞中不存在差異甲基化情況，但是KL

9、F2基因的區(qū)域4在兩種細(xì)胞間卻存在差異甲基化狀態(tài)。BSP技術(shù)的單克隆測(cè)序也進(jìn)一步證實(shí)了，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中的KLF2基因區(qū)域4甲基化水平遠(yuǎn)高于正常支氣管細(xì)胞。
　　3、甲基化酶抑制劑5-甲基-2'-脫氧胞苷處理A549、HCC827細(xì)胞株后，KLF2基因表達(dá)上調(diào)。
　　4、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)KLF2區(qū)域4能促進(jìn)熒光素酶基因的表達(dá)，而當(dāng)其被甲基化后，則又抑制基因的表達(dá)。
　　5、在47例非小細(xì)胞肺癌組織中有27

10、例(57.44％)癌組織的KLF2基因區(qū)域4是甲基化的，其中的26例肺癌組織KLF2表達(dá)水平較配對(duì)的正常組織低，說明非小細(xì)胞肺癌組織的KLF2區(qū)域4高甲基化與KLF2基因的表達(dá)下調(diào)相關(guān)。同時(shí)，KLF2區(qū)域4的甲基化狀態(tài)還與非小細(xì)胞肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)。
　　6、KLF2的過表達(dá)可以抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和克隆形成;相應(yīng)的，shRNA干擾掉KLF2的表達(dá)后可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和克隆形成。
　　7、KLF2可以使非

11、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，同時(shí)也能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡，敲降KLF2會(huì)對(duì)細(xì)胞起到相反的作用。
　　8、KLF2在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中是通過誘導(dǎo)p15和p21的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期阻滯的。
　　結(jié)論:
　　在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞株和組織樣品中KLF2表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)KLF2在非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞和組織樣品中是甲基化的。此外，KLF2表達(dá)下調(diào)與大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌組織中的KLF2區(qū)域4

12、甲基化相關(guān)，而且KLF2區(qū)域4的甲基化與非小細(xì)胞肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期的晚期相關(guān)。此外，KLF2在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中過表達(dá)能顯著抑制腫瘤細(xì)胞活力和克隆形成能力，通過誘導(dǎo)p15和p21的表達(dá)將腫瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。相比之下，KLF2表達(dá)的敲降對(duì)SK-MES-1細(xì)胞具有相反的作用。我們目前的數(shù)據(jù)提示了，KLF2蛋白可作為非小細(xì)胞肺癌中的腫瘤抑制因子，同時(shí)KLF2甲基化狀態(tài)檢測(cè)可以作為非小細(xì)胞肺癌的早期診斷