KLF2基因甲基化狀態(tài)與非小細胞肺癌的相關性及其功能的研究.pdf

1、肺癌仍是世界上致死性最高、最常見的惡性腫瘤之一，而非小細胞肺癌是其主要的類型（約80％）。肺癌每年的新增病例數為180萬，占腫瘤發(fā)病率的13％，已成為對國民健康造成嚴重威脅的疾病之一。目前，肺癌絕大多數病例在確診時已經是晚期，這就意味著治療方案選擇的局限，從而預后較差且5年生存率低。因此，尋找肺癌的新型生物標志物和更好地了解非小細胞肺癌的發(fā)生可能在改善肺癌早期診斷，治療選擇和臨床預后等方面具有重要的意義。
　　最新的研究中已經闡明

2、，大部分癌癥的發(fā)生是由于DNA在復制過程發(fā)生復制隨機錯誤造成的，但是肺癌的發(fā)生發(fā)展仍是一個涉及了遺傳和環(huán)境因素等相互作用的多步過程，其中環(huán)境因素更被認為是肺癌發(fā)生的主要原因。眾所周知，表觀遺傳學的改變與環(huán)境的作用密切相關，此外，表觀遺傳學的改變普遍是多于基因突變等先天遺傳改變的，而且這種變化大多是由于環(huán)境的影響造成的，因此它可以反映環(huán)境引起的病理變化。同時，腫瘤的發(fā)生也與表觀遺傳學的改變密不可分。腫瘤發(fā)生就是眾多表觀遺傳學改變疊加的結果

3、，這種表觀遺傳學改變的積累使得細胞基因表達水平發(fā)生變化，然后進一步影響信號通路導致細胞的惡性轉化。DNA甲基化誘導基因的沉默就是一種較為常見的表觀遺傳調控模式。有研究證實在眾多的惡性腫瘤的癌前病變中，存在多個腫瘤抑制基因的CpG島高甲基化，證明甲基化狀態(tài)的改變在癌前病變階段及腫瘤發(fā)生的早期階段就早已存在。作為腫瘤發(fā)生中的一個早期事件，基因CpG島的甲基化發(fā)生在相應正常細胞形態(tài)及功能發(fā)生改變之前。可以說，DNA甲基化可以通過表觀遺傳的方式

4、來調節(jié)基因的表達，而這一過程是動態(tài)可逆的，這一樣來DNA甲基化狀態(tài)的改變就可以用于監(jiān)測基因的調節(jié)，并作為癌癥的早期診斷、預后和治療應答的生物標志物。
　　枯否樣因子2(KLF2)也被稱為肺枯否樣因子(LKLF)，在人肺部的晚期發(fā)育中起著重要的作用，這暗示KLF2的功能缺失也可能與肺部的病變相關。同時，KLF2基因在各種癌癥組織中通常都表達較低，它可以作為潛在的腫瘤抑制基因維持細胞的正?；?。因此，不難看出，KLF2的表達缺失可能是腫

5、瘤發(fā)生的驅動因素之一。在對KLF2基因進行生物信息學分析后，我們發(fā)現在其基因序列上有一個含有267個CpG位點的CpG島，提示該基因的轉錄可能受到甲基化修飾的影響。因此，本研究將致力于探索KLF2 CpG島的甲基化改變在非小細胞肺癌中是否參與了該基因的表達調控，為以后進一步將KLF2甲基化狀態(tài)作為非小細胞肺癌的早期診斷標志物提供線索。
　　方法:
　　1、使用熒光定量PCR技術分析KLF2基因在47對非小細胞肺癌組織和相應正

6、常組織及6個細胞株中的表達情況。
　　2、使用重亞硫酸氫鹽測序PCR技術(BSP)探索KLF2在非小細胞肺癌細胞株和正常支氣管細胞中的差異甲基化區(qū)域，然后用單克隆測序的方法進一步驗證該區(qū)域的甲基化情況。
　　3、利用去甲基化試劑5-氮雜-2-脫氧胞苷處理非小細胞肺癌細胞株A549、HCC827，使用熒光定量PCR技術分析處理前后KLF2的表達情況。
　　4、使用雙熒光素酶報告基因實驗證實KLF2基因區(qū)域4（+567至+

7、906）的功能和其甲基化后對基因表達的影響。
　　5、使用甲基化特異性PCR技術(MSP)檢測非小細胞肺癌組織和相應正常組織中KLF2基因的甲基化狀態(tài)。
　　6、使用CCK-8細胞增殖試劑盒和細胞克隆形成實驗檢測敲降或重新表達KLF2后非小細胞肺癌細胞株的生存和克隆形成能力的變化。
　　7、使用流式細胞檢測技術來評估敲降或過表達KLF2后對非小細胞肺癌細胞周期分布和細胞凋亡情況的影響。
　　8、使用Western

8、蛋白印跡分析敲降或過表達KLF2后對非小細胞肺癌細胞中p15和p21表達的影響。
　　結果:
　　1、在47對非小細胞肺癌組織中，共有31對(65.96％)癌組織的KLF2表達水平比正常組織的低，且KLF2的表達與非小細胞肺癌的淋巴結轉移和TNM分期相關。與正常支氣管細胞相比，KLF2在非小細胞肺癌細胞株中表達下調。
　　2、雖然KLF2基因啟動子區(qū)域在非小細胞肺癌細胞株和正常支氣管細胞中不存在差異甲基化情況，但是KL

9、F2基因的區(qū)域4在兩種細胞間卻存在差異甲基化狀態(tài)。BSP技術的單克隆測序也進一步證實了，非小細胞肺癌細胞株中的KLF2基因區(qū)域4甲基化水平遠高于正常支氣管細胞。
　　3、甲基化酶抑制劑5-甲基-2'-脫氧胞苷處理A549、HCC827細胞株后，KLF2基因表達上調。
　　4、雙熒光素酶報告基因實驗證實KLF2區(qū)域4能促進熒光素酶基因的表達，而當其被甲基化后，則又抑制基因的表達。
　　5、在47例非小細胞肺癌組織中有27

10、例(57.44％)癌組織的KLF2基因區(qū)域4是甲基化的，其中的26例肺癌組織KLF2表達水平較配對的正常組織低，說明非小細胞肺癌組織的KLF2區(qū)域4高甲基化與KLF2基因的表達下調相關。同時，KLF2區(qū)域4的甲基化狀態(tài)還與非小細胞肺癌的淋巴結轉移和TNM分期有關。
　　6、KLF2的過表達可以抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和克隆形成;相應的，shRNA干擾掉KLF2的表達后可以促進細胞的增殖和克隆形成。
　　7、KLF2可以使非

11、小細胞肺癌細胞株的細胞周期阻滯在G0/G1期，同時也能促進肺癌細胞的凋亡，敲降KLF2會對細胞起到相反的作用。
　　8、KLF2在非小細胞肺癌細胞株中是通過誘導p15和p21的表達而實現對細胞周期阻滯的。
　　結論:
　　在本研究中，我們發(fā)現在非小細胞肺癌的細胞株和組織樣品中KLF2表達水平顯著降低，同時KLF2在非小細胞肺癌的細胞和組織樣品中是甲基化的。此外，KLF2表達下調與大多數非小細胞肺癌組織中的KLF2區(qū)域4

12、甲基化相關，而且KLF2區(qū)域4的甲基化與非小細胞肺癌的淋巴結轉移和TNM分期的晚期相關。此外，KLF2在非小細胞肺癌細胞株中過表達能顯著抑制腫瘤細胞活力和克隆形成能力，通過誘導p15和p21的表達將腫瘤細胞阻滯在G0/G1期，并促進腫瘤細胞的凋亡。相比之下，KLF2表達的敲降對SK-MES-1細胞具有相反的作用。我們目前的數據提示了，KLF2蛋白可作為非小細胞肺癌中的腫瘤抑制因子，同時KLF2甲基化狀態(tài)檢測可以作為非小細胞肺癌的早期診斷