克隆豬印跡基因表達(dá)及其甲基化狀態(tài)研究.pdf

1、豬的器官極可能成為人類(lèi)未來(lái)器官的供應(yīng)源，豬體細(xì)胞核移植及轉(zhuǎn)基因的研究雖然取得了一定的進(jìn)展，但總體來(lái)看核移植效率還很低（1％-2％）。印跡基因?qū)?dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用，在自然繁殖的動(dòng)物中，基因印跡是通過(guò)配子形成過(guò)程中甲基化狀態(tài)的改變而建立的，而克隆動(dòng)物未經(jīng)過(guò)配子形成階段，而是直接將體細(xì)胞注入去核的卵中進(jìn)行發(fā)育，這極有可能造成印跡基因的表觀遺傳修飾異常以及表達(dá)異常。本研究擬通過(guò)對(duì)克隆豬胚胎以及克隆豬個(gè)體中印跡基因的表達(dá)及甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究

2、，探索印跡基因的甲基化狀態(tài)與表達(dá)對(duì)克隆豬胚胎發(fā)育的影響，希望為提高豬體細(xì)胞核移植效率提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　 （1）利用Realtime PCR方法，對(duì)四個(gè)印跡基因（IGF2、H19、PEG3、GRB10）在存活克隆豬、死亡克隆豬和自然繁殖豬及它們分別對(duì)應(yīng)的胎盤(pán)中的表達(dá)做了分析，結(jié)果表明，四個(gè)印跡基因在死亡克隆豬胎盤(pán)中的表達(dá)水平比存活克隆豬胎盤(pán)和自然繁殖豬胎盤(pán)低，而存活克隆豬胎盤(pán)和自然繁殖豬胎盤(pán)之間差異不顯著。四個(gè)

3、印跡基因在死亡克隆豬、存活克隆豬及自然繁殖豬個(gè)體間的表達(dá)水平差異不顯著。這表明印跡基因在胎盤(pán)中的表達(dá)異?？赡苁强寺∝i發(fā)育失敗的重要原因。
　　 （2）利用亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序方法，對(duì)IGF2基因的DMR2和H19基因的CTCF3在存活克隆豬、死亡克隆豬和自然繁殖豬及它們分別對(duì)應(yīng)的胎盤(pán)中的甲基化做了分析，結(jié)果表明，IGF2和H19基因在死亡克隆豬胎盤(pán)中的甲基化水平比存活克隆豬胎盤(pán)和自然繁殖豬胎盤(pán)高，而存活克隆豬胎盤(pán)和自然繁殖豬胎盤(pán)

4、之間差異不顯著。IGF2和H19基因在死亡克隆豬、存活克隆豬及自然繁殖豬個(gè)體間的甲基化水平差異不顯著。這表明印跡基因在胎盤(pán)中的表達(dá)異?？赡苁怯捎≯E基因甲基化的異常造成的。
　　 （3）利用亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序方法，對(duì)IGF2基因的DMR2和H19基因的CTCF3在植入前核移植胚胎及體外受精胚胎中的甲基化變化做了分析，結(jié)果表明，IGF2和H19基因在核移植胚胎中呈現(xiàn)去甲基化趨勢(shì)，去甲基化主要發(fā)生在1-細(xì)胞的6-15小時(shí)及2-細(xì)胞期

5、，且兩個(gè)印跡基因去甲基化的程度相似，這可能是由核移植過(guò)程中重編程的不完全造成的。
　　 （4）利用免疫外科手術(shù)法，對(duì)體外受精和核移植的囊胚進(jìn)行了內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層的分離，通過(guò)對(duì)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層標(biāo)志性基因的檢測(cè)，證明我們分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層的方法是正確有效的。
　　 （5）利用亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序方法，對(duì)IGF2基因的DMR2和H19基因的CTCF3在核移植胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層中的甲基化做了分析，結(jié)果表明，核移植胚胎內(nèi)細(xì)胞

6、團(tuán)和滋養(yǎng)層均有不同程度的甲基化異常，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)較滋養(yǎng)層的甲基化趨于正常，這表明印跡基因甲基化正常的細(xì)胞優(yōu)先參與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的形成，而印跡基因甲基化異常的細(xì)胞優(yōu)先參與滋養(yǎng)層的形成，這可能是胎盤(pán)印跡基因異常的原因。
　　 （6）利用BrdU標(biāo)記的方法，對(duì)1-細(xì)胞期核移植胚胎DNA復(fù)制的時(shí)間進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，1-細(xì)胞期核移植胚胎主要在重構(gòu)胚激活后6-15小時(shí)進(jìn)行DNA復(fù)制，與去甲基化的時(shí)間相吻合。這表明印跡基因在核移植胚胎中的去甲基化是