小鼠卵母細(xì)胞印跡基因DNA甲基化研究.pdf

1、哺乳動物卵巢卵母細(xì)胞發(fā)育的研究，最初主要關(guān)注生殖細(xì)胞形成的早期階段或出生后卵泡的生長發(fā)育。而原始卵泡的體外形成與發(fā)育激活方面，雖然有小鼠原始卵泡體外培養(yǎng)發(fā)育并可獲得成熟的卵母細(xì)胞的報道，但減數(shù)分裂前的雌性生殖細(xì)胞不能在體外完成這一卵母細(xì)胞發(fā)生與成熟的整個發(fā)育過程，其原因至今不甚清楚。鑒于此，本研究使用了本實驗室建立的減數(shù)分裂前的生殖細(xì)胞體外發(fā)育的培養(yǎng)體系，將12.5dpc雌性胎鼠生殖嵴中的減數(shù)分裂前的生殖細(xì)胞體外培養(yǎng)28天以后獲得GV期

2、的卵母細(xì)胞，并通過亞硫酸鹽測序法檢測了這些卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中的DNA甲基化進(jìn)程，探討卵母細(xì)胞印跡基因DNA甲基化與卵母細(xì)胞體外發(fā)育阻滯的關(guān)系。
　　 本研究首先是對12.5dpc胎鼠生殖嵴進(jìn)行了體外培養(yǎng)，培養(yǎng)到7d時，出現(xiàn)圓形生殖細(xì)胞;14d時，出現(xiàn)典型的初級卵泡結(jié)構(gòu);21d時，卵母細(xì)胞直徑可達(dá)60μm，由顆粒細(xì)胞包裹，由于卵泡膜細(xì)胞的出現(xiàn)，此時已經(jīng)形成了明顯的卵泡結(jié)構(gòu)，但顆粒細(xì)胞增殖緩慢，只有2-3層，并且沒有卵泡腔的出

3、現(xiàn);27d時，卵母細(xì)胞直徑最大可達(dá)70μm以上;28d時，一些卵母細(xì)胞能夠自發(fā)的從體外培養(yǎng)的組織中游離出來，并且具有明顯的透明帶和生發(fā)泡結(jié)構(gòu)。其卵母細(xì)胞發(fā)育的各個時期，卵母細(xì)胞印跡基因Igf2r（Peg3）甲基化比例分別為6.3％、12％、9.3％和42.67％（3.3％、5.6％、4.4％和21.67％）;對照組卵母細(xì)胞分別來自于體內(nèi)0、7、14和21dpp的新生鼠卵巢，其甲基化比例分別為5.6％、52.7％、80.1％和95.33％

4、（2.2％、33.3％、76.7％和88.98％）。由上述可見，印跡基因Igf2r和Peg3甲基化印跡的建立在卵母細(xì)胞體內(nèi)生長和體外培養(yǎng)過程中存在一定差異。
　　 為了進(jìn)一步了解12.5dpc胎鼠生殖嵴體外培養(yǎng)獲得的卵母細(xì)胞印跡基因甲基化模式的建立過程，本研究分析了卵母細(xì)胞直徑與印跡基因DNA甲基化的關(guān)系。將體外培養(yǎng)28d獲得的卵母細(xì)胞分成30-45μm、45-60μm和60-75μm三組，其印跡基因Igf2r和Peg3的甲基化

5、比例分別為17.33％、33.33％和94.44％（11.1％、26.11％和45％），這表明在體外隨著卵母細(xì)胞直徑的不斷增加，Igf2r和Peg3基因的DNA甲基化比例不斷提高。相關(guān)性分析表明，卵母細(xì)胞甲基化進(jìn)程與直徑之間存在強正相關(guān)。另外，在相同直徑下，體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞印跡基因DNA甲基化進(jìn)程要慢于體內(nèi)發(fā)育。
　　 本研究中還檢測了顆粒細(xì)胞增殖和分化前后，即初級卵泡向次級卵泡轉(zhuǎn)變過程、卵泡腔形成過程對卵母細(xì)胞印跡基因甲基化狀