長牡蠣DNA甲基化研究.pdf

1、表觀遺傳學(xué)是指在DNA序列不發(fā)生改變的情況下基因表達(dá)發(fā)生的可遺傳的改變，DNA甲基化是目前研究最為成熟的一種表觀遺傳修飾，與基因組防御、基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。目前DNA甲基化的研究主要集中在哺乳動(dòng)物及植物中，水產(chǎn)動(dòng)物的研究相對匱乏。長牡蠣（Crassostrea gigas）又名太平洋牡蠣，是我國乃至世界上產(chǎn)量最大的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類，因其生活于環(huán)境多變的潮間帶并且具有復(fù)雜的生物學(xué)特征而成為水產(chǎn)動(dòng)物研究的模式生物，對長牡蠣的DNA甲基化進(jìn)行研

2、究有助于了解水產(chǎn)動(dòng)物DNA甲基化的分子機(jī)制和功能，解析水產(chǎn)動(dòng)物復(fù)雜生物學(xué)特征及對環(huán)境適應(yīng)性的調(diào)控機(jī)理。本研究針對長牡蠣開展了DNA甲基化的基礎(chǔ)研究，分析了DNA甲基化的遺傳模式、組織特異性及三倍體和選育群體中DNA甲基化的變異，以期為后期相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。
　　1、長牡蠣DNA甲基化的遺傳模式
　　采用熒光標(biāo)記的甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(F-MSAP)方法，研究長牡蠣親本甲基化和非甲基化位點(diǎn)在子代的分離，檢測DNA甲基化在親

3、子代間的遺傳模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長牡蠣90.6％的親本甲基化位點(diǎn)遵循孟德爾定律穩(wěn)定遺傳給子代，甲基化位點(diǎn)較非甲基化位點(diǎn)更加偏離孟德爾分離比，與親本相比，子代存在22個(gè)去甲基化位點(diǎn)，7個(gè)超甲基化位點(diǎn)和30個(gè)從頭甲基化位點(diǎn)。
　　2、DNA甲基化在長牡蠣不同組織中的分化
　　采用F-MSAP方法對10只野生長牡蠣6個(gè)組織（鰓、外套膜、閉殼肌、唇瓣、性腺、消化盲囊）的基因組甲基化進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長牡蠣不同組織間DNA甲基化水平存在

4、差異，消化盲囊、唇瓣、閉殼肌組織的甲基化水平較高，其中消化盲囊與鰓和外套膜組織的甲基化水平差異顯著，其他組織間差異并不顯著。長牡蠣中存在組織特異性和非組織特異性甲基化位點(diǎn)，然而由于牡蠣雜合度高，個(gè)體之間差異較大，未發(fā)現(xiàn)10個(gè)個(gè)體一致存在的組織特異性/非組織特異性甲基化位點(diǎn)。
　　3、長牡蠣三倍體基因組DNA甲基化研究
　　采用細(xì)胞松弛素B誘導(dǎo)產(chǎn)生長牡蠣二倍體和三倍體家系，采用F-MSAP方法對二倍體和三倍體的閉殼肌和性腺組織

5、的DNA甲基化進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二倍體與三倍體長牡蠣整體DNA甲基化水平在閉殼肌和性腺組織中都不存在差異，僅存在少量倍性特異性位點(diǎn)。通過與親本基因型比較發(fā)現(xiàn)，三倍體的甲基化位點(diǎn)和未甲基化位點(diǎn)的變異率都高于二倍體。基于主成分分析方法對二倍體和三倍體的閉殼肌及性腺組織的表觀遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示，長牡蠣不同倍性及不同組織之間的表觀遺傳結(jié)構(gòu)存在較大差異，這暗示了二倍體與三倍體可能在某些甲基化位點(diǎn)存在差異，而不引起整體甲基化水平的變化。二倍體和三倍

6、體長牡蠣中，都存在雄性特異性甲基化位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)雌性中特有的甲基化位點(diǎn)。
　　4、長牡蠣三倍體生殖相關(guān)基因表達(dá)與甲基化模式分析
　　采用定量PCR對8個(gè)生殖相關(guān)基因在增值期和成熟期的二倍體和三倍體性腺組織的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有增殖期的putative Vg基因和成熟期的caER基因在二倍體與三倍體中表達(dá)差異顯著。采用亞硫酸鹽處理測序方法對這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子及編碼區(qū)的CpG島甲基化情況進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Putative

7、 Vg基因啟動(dòng)子及編碼區(qū)含有6個(gè)CpG島，但所有CpG島不存在胞嘧啶甲基化修飾，caER基因啟動(dòng)子區(qū)域無CpG島，編碼區(qū)含有5個(gè)CpG島，位于第六外顯子和第十外顯子的CpG島存在甲基化修飾，其中第六外顯子CpG島胞嘧啶甲基化在二倍體和三倍體中不存在差異，而第十外顯子CpG島胞嘧啶甲基化在二倍體和三倍體中存在差異，可能與基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)。
　　5、長牡蠣人工選育群體DNA甲基化研究
　　采用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)方法和

8、甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)方法對長牡蠣快生長品系“海大一號”基礎(chǔ)群體和選育群體的遺傳及表觀遺傳變異進(jìn)行分析。結(jié)果顯示基礎(chǔ)群體與選育群體總體DNA甲基化水平并無差異，然而對每個(gè)甲基化位點(diǎn)在兩個(gè)群體中出現(xiàn)頻率進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，82個(gè)甲基化位點(diǎn)中有9個(gè)位點(diǎn)在兩個(gè)群體中出現(xiàn)的頻率存在顯著差異。協(xié)慣量方差分析顯示表觀遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)，但是部分個(gè)體具有相似的遺傳結(jié)構(gòu)卻表現(xiàn)出差異較大的表觀遺傳結(jié)構(gòu)，選育群體的遺傳多樣性與表觀遺傳多樣性都略