檢測(cè)DNA甲基化新型微陣列芯片研究.pdf

1、DNA甲基化是～種重要的表觀遺傳學(xué)修飾，在過(guò)去的10年，DNA甲基化研究領(lǐng)域快速發(fā)展并成為分子遺傳學(xué)的一個(gè)重要分支。DNA甲基化參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，X染色體失活，發(fā)育調(diào)控和細(xì)胞分化。異常的DNA甲基化與癌癥及許多其他疾病的發(fā)生密切相關(guān)。然而，目前對(duì)于DNA甲基化在人類基因組中的認(rèn)識(shí)十分有限。一定程度上說(shuō)缺少高通量的研究技術(shù)是阻礙基因組水平研究DNA甲基化功能的關(guān)鍵原因。基因芯片由于其極高的檢測(cè)通量，在基因組學(xué)、藥物學(xué)、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等領(lǐng)域中得

2、到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注。本論文DNA甲基化為研究對(duì)象，從探針設(shè)計(jì)、DNA模板制備、甲基化特異識(shí)別分子和檢測(cè)方式等多種角度，提出一系列創(chuàng)新性思路與方法，設(shè)計(jì)新型的檢測(cè)DNA甲基化微陣列芯片，并利用這些芯片檢測(cè)技術(shù)，開(kāi)展了對(duì)腫瘤細(xì)胞系和癌癥樣本的甲基化研究，這些技術(shù)包括：用于測(cè)定多個(gè)特定CpG位點(diǎn)的單堿基單熒光延伸檢測(cè)DNA甲基化技術(shù)和單堿基雙熒光檢測(cè)DNA甲基化技術(shù)，用于測(cè)定CpG島密度的基于通用靶標(biāo)序列微陣列的CpG島高甲基化測(cè)定技術(shù)、基

3、于滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)CpG島高甲基化檢測(cè)技術(shù)、利用甲基化結(jié)合蛋白測(cè)定DNA甲基化密度的方法以及不只是限于甲基化測(cè)定的基于硫代保護(hù)的DNA測(cè)序技術(shù)。具體內(nèi)容如下：
　　 1.單堿基單熒光延伸檢測(cè)DNA甲基化技術(shù)
　　 我們以p16和E-cad基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島為研究對(duì)象，針對(duì)要檢測(cè)的CpG位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)5′末端為氨基，3′末端堿基為C或T，特異識(shí)別亞硫酸氫鹽反轉(zhuǎn)后甲基化與非甲基化變化的探針，探針對(duì)的數(shù)量與要研究的目的片段中C

4、pG位點(diǎn)數(shù)量一致，并將這些探針對(duì)點(diǎn)樣于醛基片上構(gòu)建微陣列。將10例乳腺癌細(xì)胞系和2例正常人外周血細(xì)胞DNA用亞硫酸氫鹽處理，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，得到雙鏈DNA片段，其中非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?T)，甲基化胞嘧啶經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后轉(zhuǎn)變?yōu)榉羌谆奏?C)，再將PCR產(chǎn)物用外切酶處理成為單鏈，將單鏈化模板與探針對(duì)微陣列進(jìn)行雜交并在片延伸帶有熒光標(biāo)記的dGTP，由延伸信號(hào)的強(qiáng)弱可以清楚準(zhǔn)確的識(shí)別模板中的甲基化狀態(tài)。
　　 為了能夠同時(shí)得

5、到樣本中特定CpG位點(diǎn)甲基化與非甲基化的信息，我們使用兩種不同的熒光標(biāo)記物(Cy3-dUTP和Cy5-dCTP)并設(shè)計(jì)了一種新穎的探針?lè)肿?，其結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)部分：靠近5′端部分為唯一性序列標(biāo)簽，靠近3′端部分為位點(diǎn)特異性序列，該位點(diǎn)特異性序列識(shí)別的是緊挨著某一特定CpG位點(diǎn)的3′端序列，并將可能覆蓋到的其他CpG位點(diǎn)做簡(jiǎn)并處理。將氨基標(biāo)記的與唯一性序列標(biāo)簽互補(bǔ)的靶標(biāo)點(diǎn)樣于醛基片上構(gòu)建微陣列。我們以p16和E-cad基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島為

6、研究對(duì)象，將5例乳腺癌細(xì)胞系DNA和8例未經(jīng)放療或化療的乳腺癌及相應(yīng)癌旁組織樣本DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽反轉(zhuǎn)，保留甲基化信息；PCR擴(kuò)增出目的片段與帶有唯一性序列標(biāo)簽的位點(diǎn)特異性探針雜交，延伸單個(gè)帶有熒光標(biāo)記的堿基(Cy3-dUTP或Cy5-dCTP)，最后與靶標(biāo)微陣列雜交，Cy3信號(hào)強(qiáng)度代表CpG位點(diǎn)的非甲基化程度，Cy5則代表同一位點(diǎn)的甲基化程度。
　　 3.基于通用靶標(biāo)序列微陣列的CpG島高甲基化測(cè)定技術(shù)
　　 除了特

7、定CpG位點(diǎn)的甲基化信息，不同基因CpG島的整體甲基化狀態(tài)更利于臨床性研究與診斷。本技術(shù)所使用的帶有唯一性序列標(biāo)簽的序列特異性探針其序列特異性部分識(shí)別的不再是某個(gè)特定的CpG位點(diǎn)，而是特定的CpG島片段，與唯一性序列標(biāo)簽對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)，其規(guī)?？梢愿鶕?jù)研究需要加以擴(kuò)大或減少，由于標(biāo)簽和靶標(biāo)與研究對(duì)象、研究目的沒(méi)有相關(guān)性，使得該技術(shù)更具通用性。該技術(shù)一種分析CpG島高甲基化狀態(tài)的半定量技術(shù)，我們以16個(gè)基因的64個(gè)CpG島為測(cè)定對(duì)象，將33例樣

8、本的基因組DNA經(jīng)過(guò)MseⅠ酶切，割膠獲取適當(dāng)?shù)膮^(qū)域，將純化后的酶切片段連接上公共的連接子，連接后的片段用甲基化敏感性酶HpaⅡ和HhaⅠ保留高甲基化信息，然后進(jìn)行Linker-PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物與帶有唯一性序列標(biāo)簽的序列特異性探針雜交并延伸出熒光信號(hào)；延伸產(chǎn)物與通用靶標(biāo)微陣列雜交進(jìn)行信號(hào)掃描，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，判斷甲基化程度的高低。
　　 4.基于滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)CpG島高甲基化檢測(cè)技術(shù)
　　 除了從設(shè)計(jì)新型探針角度出發(fā)構(gòu)建

9、DNA甲基化測(cè)定芯片之外，我們還研究了利用滾環(huán)擴(kuò)增制備用于甲基化測(cè)定的全基因組模板的可行性。進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增的前提是制備環(huán)狀的模板，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種發(fā)卡結(jié)構(gòu)的連接子，成功的制備出了啞鈴狀環(huán)狀DNA模板。我們以p16基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島片段為檢測(cè)對(duì)象，分析了12例肝癌細(xì)胞系基因組DNA滾環(huán)擴(kuò)增結(jié)果?；蚪M模板先用Tsp509I酶進(jìn)行酶切，保留了大部分CpG島的完整；酶切片段與發(fā)卡結(jié)構(gòu)的連接子連接，形成啞鈴狀環(huán)狀分子；用甲基化敏感酶Hpa Ⅱ保留

10、高甲基化片段，用兩種外切酶，Lambda外切酶和Exonuclease Ⅰ，去除非環(huán)狀分子，加入Phi29DNA聚合酶進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物固定在尼龍膜上，與地高辛標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，最后用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)成功獲得甲基化信息。
　　 5.利用甲基化結(jié)合蛋白測(cè)定DNA甲基化密度的方法
　　 通常用于甲基化檢測(cè)的標(biāo)記分子是核苷酸單體，其上標(biāo)記著放射性同位素、熒光、生物素等；此外還有識(shí)別甲基化胞嘧啶的抗體以及甲基供體。本方法將

11、甲基化結(jié)合蛋白(HMBD)與熒光分子相偶聯(lián)，利用這種標(biāo)記分子構(gòu)建了一種檢測(cè)DNA甲基化密度的微陣列芯片。甲基化結(jié)合蛋白能購(gòu)識(shí)別甲基化的CpG二聯(lián)體，為了區(qū)分目標(biāo)序列中CpG位點(diǎn)的甲基化和非甲基化狀態(tài)，我們首先將7例肝癌細(xì)胞系和2例正常人外周血樣本基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理，利用PCR擴(kuò)增，獲得6種不同CpG島片段產(chǎn)物，將擴(kuò)增后的帶氨基標(biāo)記的PCR產(chǎn)物固定在醛基片上，構(gòu)建微陣列芯片，用甲基化轉(zhuǎn)移酶SssⅠ將芯片上PCR產(chǎn)物中的所有Cp

12、G位點(diǎn)甲基化，用末端轉(zhuǎn)移酶TdT將TAMRA-dUTP轉(zhuǎn)移到固定在基片上的PCR產(chǎn)物末端，用TAMRA的量表示固定PCR產(chǎn)物的量，將基片與Cy5-HMBD蛋白孵育，Cy5熒光強(qiáng)度表示甲基化位點(diǎn)的數(shù)量；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，Cy5/TAMRA的比值表示目標(biāo)區(qū)域中甲基化CpG的密度。
　　 6.基于硫代保護(hù)的DNA測(cè)序技術(shù)
　　 DNA測(cè)序技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景，其應(yīng)用范圍不僅限于甲基化研究，國(guó)內(nèi)目前尚未發(fā)展出可以與Solexa和S

13、olid技術(shù)相媲美的測(cè)序方法。我們希望發(fā)展出擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的測(cè)序技術(shù)，由此我們提出了基于硫代保護(hù)的DNA測(cè)序技術(shù)原型，并對(duì)其進(jìn)行了可行性研究，該技術(shù)主要利用外切酶Ⅲ對(duì)雙鏈DNA具有特異性的3′→5′外切活性，而硫代核苷鍵對(duì)外切酶Ⅲ的外切活性具有拮抗作用的特性。我們以T7噬菌體基因組DNA為模板，將其超聲破碎后進(jìn)行環(huán)化，環(huán)化基因組片段模板在乳液液滴中得以單克隆擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物固定在固相基底上，變性去除互補(bǔ)鏈之后，雜交上硫代修飾的測(cè)序引物

14、；用含有單一已知核苷酸單體混合物（熒光標(biāo)記的與正常的核苷酸單體）的延伸反應(yīng)溶液進(jìn)行延伸反應(yīng)，此時(shí)，形成的是正常的核苷鍵；延伸上的熒光堿基通過(guò)外切酶Ⅲ的3′-→5′外切活性去除；然后延伸具有與已知核苷酸相同類型的硫代核苷酸單體，使之形成硫代核苷鍵，拮抗下一次的酶切反應(yīng)，確保引物進(jìn)一步向前延伸，用含第二種己知核苷酸單體的延伸反應(yīng)溶液進(jìn)行延伸反應(yīng)，重復(fù)之前的步驟。根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，只有加入的核苷酸單體與緊接著延伸的模板上的堿基相互配對(duì)，延