建立分支DNA技術(shù)用于HBV DNA定量并評(píng)價(jià)微陣列芯片檢測(cè)HBV耐藥的性能特點(diǎn).pdf

1、目的:
　　1.建立分支DNA信號(hào)放大技術(shù)（branched DNA,bDNA）定量檢測(cè)乙型肝炎病毒DNA（Hepatitis B VirusDNA,HBV DNA），并評(píng)價(jià)其性能特點(diǎn)及其臨床應(yīng)用價(jià)值，為將該技術(shù)應(yīng)用于HBV感染的診斷和療效判斷奠定基礎(chǔ)。
　　2.評(píng)價(jià)DNA微陣列芯片法檢測(cè)慢性乙型肝炎拉米夫定和阿德福韋酯耐藥突變的性能特點(diǎn)及其臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:
　　1.根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的中國(guó)HBV B、C型基

2、因組全序列，設(shè)計(jì)一套堿性磷酸酶標(biāo)記的探針，包括：捕獲探針組、特異性捕獲劑、標(biāo)記體、前放大體探針組、放大體探針組和標(biāo)記探針組，將捕獲探針包被在96孔聚氯乙烯板上，依序與HBV DN A、前放大體探針組、放大體探針組、標(biāo)記探針組雜交，將雜交信號(hào)級(jí)聯(lián)放大，用北京源德生物有限公司JETLIA-962型發(fā)光儀檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)值，計(jì)算結(jié)果。
　　2.制備標(biāo)準(zhǔn)品：收集5例高HBV DNA載量的HBV感染者血清標(biāo)本共5ml作為標(biāo)準(zhǔn)品，用實(shí)時(shí)熒光定

3、量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time Fluorescent Quantitativepolymerase chain reaction，RT-qPCR）法連續(xù)4天對(duì)其HBV DNA進(jìn)行定量，共定量20次，其平均值1.87E+08copies/ml作為標(biāo)準(zhǔn)品HBV DNA的拷貝數(shù)定值。
　　3.優(yōu)化反應(yīng)條件，包括改變裂解液含量、裂解液反應(yīng)時(shí)間的改進(jìn)、探針雜交時(shí)間的等；進(jìn)行線性范圍、特異性、重復(fù)性及干擾試驗(yàn)。
　　4.檢測(cè)84例

4、HBV感染者血清中HBV DNA的含量，與RT-qPCR法檢測(cè)結(jié)果比較，評(píng)價(jià)該方法的臨床應(yīng)用價(jià)值。用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　5.收集已經(jīng)發(fā)生拉米夫定（Lamivudine,LAM）或阿德福韋酯（AdefovirDipivoxil,ADV）臨床耐藥的慢性乙型肝炎（Chronicviral hepatitis type B,CHB）患者血清標(biāo)本48份，同時(shí)采用DNA微陣列芯片法和直接測(cè)序法對(duì)HBV逆轉(zhuǎn)錄區(qū)

5、位點(diǎn)rtL180、rtM204、rtA181、rtN236進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性。
　　結(jié)果:
　　1.bDNA技術(shù)用于HBV DNA定量，線性范圍為104copies/ml~107copies/ml；HBV DNA濃度為107copies/ml、105copies/ml、104copies/ml的批內(nèi)變異系數(shù)（Coefficient of variation,CV）分別為：2.60％、1.49%、1.35%

6、；批間CV分別為：11.6%、9.82%、5.61%，重復(fù)性好；對(duì)丙肝病毒（Hepatitis C Virus,HCV）、沙眼支原體（Chlamydia trachomatis,CT）、單純皰疹病毒（Herpes simplex virus,HSV）、人類(lèi)乳頭瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）等不出現(xiàn)發(fā)光值的特異性增長(zhǎng)，特異性好。
　　2.經(jīng)檢測(cè)的84份血清樣本，兩種方法陽(yáng)性符合率為85.7%（72/84，

7、Kappa=0.694，P＜0.05），HBV DNA平均含量RT-qPCR法為4.24log10拷貝/ml，范圍：0～8.36log10（4.24±3.08log10），bDNA法為3.85log10拷貝/ml，范圍：0～8.27log10（3.85±3.42log10），RT-qPCR測(cè)得HBV DNA平均含量明顯高于bDNA法（P<0.05），二法檢測(cè)結(jié)果顯著相關(guān)（r=0.904，P<0.01）。
　　3.微陣列芯片法和直接

8、測(cè)序均成功地檢測(cè)48份標(biāo)本中的192個(gè)耐藥基因型，其中耐藥型突變40例，野生型8例，44例標(biāo)本結(jié)果完全一致，2種方法檢測(cè)HBV突變結(jié)果的完全符合率為91.67%。4例標(biāo)本結(jié)果不符：1例用直接測(cè)序法測(cè)出rtA181T突變，微陣列芯片測(cè)出除了rtA181T外的另外2個(gè)突變位點(diǎn)（rtL180M，rtM204V）；1例用直接測(cè)序法檢測(cè)出rtA181T突變，微陣列芯片測(cè)出除了rtA181T外的另外1個(gè)突變位點(diǎn)（rtN236T）；2例用直接測(cè)序法檢

9、測(cè)出rtM204I突變，微陣列芯片測(cè)出除了rtM204I外的另外2個(gè)突變位點(diǎn)（rtL180M、rtM204V）。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立了bDNA技術(shù)用于HBV DNA的定量檢測(cè)，其結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠，可用于HBV感染的診斷和療效判斷。
　　2.DNA微陣列芯片法檢測(cè)HBV耐藥突變與直接測(cè)序法相比符合率高，具有高通量的特點(diǎn)，在微陣列芯片法所覆蓋的幾個(gè)已知突變位點(diǎn)的檢測(cè)中，微陣列芯片法能檢測(cè)直接測(cè)序法不能檢測(cè)到的