建立分支DNA技術(shù)用于HBV DNA定量并評價微陣列芯片檢測HBV耐藥的性能特點.pdf

1、目的:
　　1.建立分支DNA信號放大技術(shù)（branched DNA,bDNA）定量檢測乙型肝炎病毒DNA（Hepatitis B VirusDNA,HBV DNA），并評價其性能特點及其臨床應(yīng)用價值，為將該技術(shù)應(yīng)用于HBV感染的診斷和療效判斷奠定基礎(chǔ)。
　　2.評價DNA微陣列芯片法檢測慢性乙型肝炎拉米夫定和阿德福韋酯耐藥突變的性能特點及其臨床應(yīng)用價值。
　　方法:
　　1.根據(jù)文獻報道的中國HBV B、C型基

2、因組全序列，設(shè)計一套堿性磷酸酶標記的探針，包括：捕獲探針組、特異性捕獲劑、標記體、前放大體探針組、放大體探針組和標記探針組，將捕獲探針包被在96孔聚氯乙烯板上，依序與HBV DN A、前放大體探針組、放大體探針組、標記探針組雜交，將雜交信號級聯(lián)放大，用北京源德生物有限公司JETLIA-962型發(fā)光儀檢測化學發(fā)光信號值，計算結(jié)果。
　　2.制備標準品：收集5例高HBV DNA載量的HBV感染者血清標本共5ml作為標準品，用實時熒光定

3、量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time Fluorescent Quantitativepolymerase chain reaction，RT-qPCR）法連續(xù)4天對其HBV DNA進行定量，共定量20次，其平均值1.87E+08copies/ml作為標準品HBV DNA的拷貝數(shù)定值。
　　3.優(yōu)化反應(yīng)條件，包括改變裂解液含量、裂解液反應(yīng)時間的改進、探針雜交時間的等；進行線性范圍、特異性、重復(fù)性及干擾試驗。
　　4.檢測84例

4、HBV感染者血清中HBV DNA的含量，與RT-qPCR法檢測結(jié)果比較，評價該方法的臨床應(yīng)用價值。用SPSS11.5統(tǒng)計學軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。
　　5.收集已經(jīng)發(fā)生拉米夫定（Lamivudine,LAM）或阿德福韋酯（AdefovirDipivoxil,ADV）臨床耐藥的慢性乙型肝炎（Chronicviral hepatitis type B,CHB）患者血清標本48份，同時采用DNA微陣列芯片法和直接測序法對HBV逆轉(zhuǎn)錄區(qū)

5、位點rtL180、rtM204、rtA181、rtN236進行檢測，比較兩種方法檢測結(jié)果的一致性。
　　結(jié)果:
　　1.bDNA技術(shù)用于HBV DNA定量，線性范圍為104copies/ml~107copies/ml；HBV DNA濃度為107copies/ml、105copies/ml、104copies/ml的批內(nèi)變異系數(shù)（Coefficient of variation,CV）分別為：2.60％、1.49%、1.35%

6、；批間CV分別為：11.6%、9.82%、5.61%，重復(fù)性好；對丙肝病毒（Hepatitis C Virus,HCV）、沙眼支原體（Chlamydia trachomatis,CT）、單純皰疹病毒（Herpes simplex virus,HSV）、人類乳頭瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）等不出現(xiàn)發(fā)光值的特異性增長，特異性好。
　　2.經(jīng)檢測的84份血清樣本，兩種方法陽性符合率為85.7%（72/84，

7、Kappa=0.694，P＜0.05），HBV DNA平均含量RT-qPCR法為4.24log10拷貝/ml，范圍：0～8.36log10（4.24±3.08log10），bDNA法為3.85log10拷貝/ml，范圍：0～8.27log10（3.85±3.42log10），RT-qPCR測得HBV DNA平均含量明顯高于bDNA法（P<0.05），二法檢測結(jié)果顯著相關(guān)（r=0.904，P<0.01）。
　　3.微陣列芯片法和直接

8、測序均成功地檢測48份標本中的192個耐藥基因型，其中耐藥型突變40例，野生型8例，44例標本結(jié)果完全一致，2種方法檢測HBV突變結(jié)果的完全符合率為91.67%。4例標本結(jié)果不符：1例用直接測序法測出rtA181T突變，微陣列芯片測出除了rtA181T外的另外2個突變位點（rtL180M，rtM204V）；1例用直接測序法檢測出rtA181T突變，微陣列芯片測出除了rtA181T外的另外1個突變位點（rtN236T）；2例用直接測序法檢

9、測出rtM204I突變，微陣列芯片測出除了rtM204I外的另外2個突變位點（rtL180M、rtM204V）。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立了bDNA技術(shù)用于HBV DNA的定量檢測，其結(jié)果穩(wěn)定、準確、可靠，可用于HBV感染的診斷和療效判斷。
　　2.DNA微陣列芯片法檢測HBV耐藥突變與直接測序法相比符合率高，具有高通量的特點，在微陣列芯片法所覆蓋的幾個已知突變位點的檢測中，微陣列芯片法能檢測直接測序法不能檢測到的