HBV X-DNA-早期檢測拉米夫定治療中耐藥性發(fā)展的血清標志物.pdf

1、目的：乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是一個全球性的公共健康問題。我國是HBV感染的高發(fā)區(qū)，在全世界3.5億無癥狀HBV攜帶者(chronic asymptomatic HBV carrier,AsC)中，中國占1.3億，慢性乙型肝炎患者2800萬。HBVDNA有4個重疊的開放式閱讀框架（Open Reading Frame,ORF），即：PreC/C、多聚酶、PreS1/PreS2/S和X基因，其可被轉(zhuǎn)錄

2、到基因組和前基因組RNA分子中。其中最小的病毒轉(zhuǎn)錄體HBx翻譯產(chǎn)物被認為是肝癌的致癌因子，HBx的特性包括刺激轉(zhuǎn)錄和信號轉(zhuǎn)導、干擾DNA修復、誘導凋亡、促進體內(nèi)體外的惡性轉(zhuǎn)化。在HBV復制期間，在HBxORF產(chǎn)生兩種病毒轉(zhuǎn)錄體，即：全長型轉(zhuǎn)錄體（Full-length RNA，fRNA），Poly(A)信號成熟位于（1789位）UAUAAA結(jié)構(gòu)區(qū)；及頓挫型轉(zhuǎn)錄體（Truncated RNA trRNA），成熟的Poly(A)信號位于（1

3、661位）CAUAAA結(jié)構(gòu)區(qū)。后者隱藏于HBx基因ORF內(nèi)，只有當fRNA成熟信號被滅活時，trRNA成熟信號才具有活性。1996年Schutz等建立用于檢測肝組織內(nèi)HBV轉(zhuǎn)錄體的方法；2001年以來，Su和Zhang等先后建立了從血清中檢測這兩種轉(zhuǎn)錄體的定性和定量檢測方法。本實驗室前期關于血清HBV核酸研究結(jié)果表明，短期拉米夫定治療慢性感染患者引起阻斷于負鏈合成早期的復制早期中間體的快速波動。相反，病毒mRNA的形成卻基本未受影響。在

4、此，我們對兩名經(jīng)長期拉米夫定干預治療的患者進行研究，探討無明顯復制期HBV血清核酸標志物。
　　方法：自兩名HBV表面抗原(HBsAg)和E抗原（HBeAg）陽性、經(jīng)長期拉米夫定干預治療的HBV慢性感染患者血清中提取核酸，采用本實驗已建立的方法，經(jīng)PCR定量HBVX區(qū)、C區(qū)、preC區(qū)DNA及相應的RNA，將全長型RNA(FulllengthRNA,fRNA)和頓挫型RNA（Truncated RNA,trRNA）作為poly(A

5、)RNA測定，PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳顯示結(jié)果，Southern-blotting驗證反應的特異性。
　　結(jié)果：患者1的病毒DNA分別在12個月（XDNA）、9個月（CDNA）、8個月（PreCDNA）內(nèi)從109·mL-1下降為103·mL-1。各自RNA片段的減少也表現(xiàn)為相似的動力學。然而在早期的時間點，RNA的拷貝數(shù)要比相應的DNA低（106－107）。在第6個月，患者1被檢測出形成YVDD突變。在第16、17和18個月

6、，僅見X區(qū)DNA和RNA早期反跳和連續(xù)性下降。從第19，20，21個月開始，X，C和PreCDNA各自表現(xiàn)為穩(wěn)步增長。相應的X，C和PreCRNA片段的拷貝數(shù)也遵循類似的模式，卻未達到各自DNA片段的水平。也就是說，它們沒有達到開始拉米夫定治療時的水平。檢測Poly(A)RNA（即fRNA和trRNA）來測定病毒DNA的轉(zhuǎn)錄活性，全長型RNA的消失和反跳與所觀察到的DNA片段類似。與fRNA相比，頓挫型RNA持續(xù)時間更為長久，且其更早再

7、現(xiàn)。肝損傷標志物ALT和AST的模式與病毒核酸的消失與重現(xiàn)平行。
　　患者2未出現(xiàn)YMDD突變。鑒于6個月未查到病毒復制標志物，在對其進行拉米夫定治療20個月后停藥。在第24個月，由于ALT/AST重新上升，為改善肝功能[121]，對其采用混合中草藥提取物治療。由于HBeAg在第27個月重新出現(xiàn)，采用中草藥＋干擾素2α到第30個月，未見明顯效果。因此，重新對其開始拉米夫定治療，并被證明有效?；颊?的DNA和RNA與患者1有相似的表

8、現(xiàn)。在病毒復制反跳期間，trRNA較fRNA存在更久、且出現(xiàn)更早。與患者1類似，其HBeAg與ALT/AST同病毒復制平行。
　　證實了阻斷早期中間體的優(yōu)先形成。由于出現(xiàn)抗藥性突變（患者1）和不連續(xù)的治療（患者2），兩名患者均可見到病毒復制迅速反跳。fRNA隨PreCDNA、trRNA隨XDNA水平變化，在治療后期的某些時間點，trRNA是唯一出現(xiàn)的poly(A)病毒RNA。
　　結(jié)論：HBVX-DNA是早期檢測拉米夫定治療