細菌耐藥性檢測課件

1、細菌的耐藥性與耐藥細菌檢測,細菌耐藥性,指細菌與抗生素多次接觸后，對抗生素的敏感性下降甚至消失，致使抗生素對耐藥菌的療效降低或無效。耐藥的程度以最小抑菌濃度（MIC）表示,細菌如何產生耐藥性？,細菌如何產生抗藥性？,,據(jù)國內權威醫(yī)療機構調查統(tǒng)計：我國每年約有２０萬人死于藥品不良反應，其中４０％（８萬人）死于抗生素濫用?！翱股乇旧頍o辜，問題在于人們?yōu)E用了它。”“抗生素如同一把雙刃劍，合理使用當然有益，使用不當就會傷害自己?！?

2、細菌產生耐藥性的原因,服藥療程不足： 用藥不當： 重復用藥： 劑量不足： 藥物交互作用：,服藥療程不足：很多病人以為癥狀已經緩解就不需再服藥，令所幸存的細菌開始產生耐藥性，留在病人體內，甚至傳播到他人。用藥不當：醫(yī)生在某些情況下會誤用抗生素, 又或者因應病人要求而濫用抗生素, 不是細菌引起的疾病(例如多數(shù)傷風由病毒引起)，卻使用抗生素治療，不但對癥狀毫無幫助，更促使細菌產生抗藥。重複用藥：要時抗生素的應用廣泛，在醫(yī)學

3、，動植物及農業(yè)上都大量應用抗生素.若重複使用某種抗生素，細菌會慢慢學習改造自己以產生抗藥性，就像適應環(huán)境一樣，最後就不會被該種抗生素殺死。劑量不足：當抗生素劑量不足，只能殺死部分細菌，存活下來的細菌，為求生存就利用基因轉變等方法改造自己，而不再被相同的抗生素消滅。藥物交互作用：有些藥物若與抗生素共同服用，會在身體內產生化學反應，而減低抗生素的效用，造成無法殺死細菌，存活的細菌因此產生抗藥性。,細菌耐藥性的分類,（一）固有耐藥性&#

4、160;   指天然耐藥性。是由細菌染色體決定的，具有穩(wěn)定的遺傳性，可代代相傳，故有絕對耐藥之說，如革蘭氏陰性菌對早期青霉素天然耐藥，產氣桿菌對頭孢西丁天然耐藥等。,常見細菌的天然耐藥,（二）獲得耐藥性,由于細菌基因的突變、耐藥基因片段的轉化、質粒的轉移、噬菌體的轉導等原因，導致細菌產生耐藥。,基因突變,耐藥基因位于染色體上，隨細菌分裂傳至后代基因突變頻率105~109通常只對1，2種類似藥物產生耐藥,質粒介導

5、的耐藥性,質粒是位于染色體外的DNA R質粒—耐藥質粒 接合型 非接合型接合型：耐藥決定因子+耐藥接合因子非接合型：耐藥決定因子轉移方式：接合型：接合轉移 非接合型：轉化、轉導等方式,,,,基因傳播的方式,轉化：耐藥菌溶解后釋放的DNA進入敏感菌體內，其耐藥基因與敏感菌中的同種基因重新組合，使其變成耐藥菌。

6、轉導：耐藥菌以噬菌體為媒介將耐藥基因轉移給敏感菌的現(xiàn)象。轉座：耐藥基因可自一個質粒轉座到另一個質粒，叢質粒到染色體或從染色體到噬菌體等的現(xiàn)象。,細菌主要耐藥機制,一、水解酶或鈍化酶的產生二、靶位結構改變三、抗生素滲透屏障作用四、主動外排功能增強（泵出機制）五、細菌菌膜形成,一、滅活酶或鈍化酶的產生,β-內酰胺酶可以打開β-內酰胺類藥物分子結構中的β-內酰胺環(huán)，使其完全失去抗菌活性。 氨基糖苷類藥物鈍化酶、氯霉

7、素乙酰轉移酶、MLS（大環(huán)內酯類、林可霉素、鏈陽菌素類）抗菌藥物鈍化酶，可催化某些基團結合到抗生素上，使之失活。,二、靶位結構改變,藥物作用的靶位發(fā)生改變：使抗生素不易與之結合。     如利福平作用點是RNA聚合酶的β亞基，當β亞基的編碼基因突變時，就產生了耐藥性。,主要抗菌藥物作用靶位,β-內酰胺類-青霉素結合蛋白（PBP）氨基糖苷類-核糖體30S亞基大環(huán)內酯類-核糖體50S亞基氟喹諾酮

8、類-DNA旋轉酶（拓撲異構酶Ⅱ）、拓撲異構酶Ⅳ糖肽類D-丙氨酰D-丙氨酸四環(huán)素類-核糖體50S亞基,三、抗生素滲透屏障作用,細菌可通過各種途徑使抗生素不易進入菌體，如某些桿菌的細胞外膜對青霉素等有天然屏障作用；還有些細菌可通過細胞壁水孔或細胞外膜通道的改變，使抗生素不易滲透至細菌體內，產生耐藥。,四、主動外排功能增強,有些抗菌藥物（常見的有四環(huán)素與喹諾酮類）能誘導細菌主動外排，抗菌藥物難以在菌體內積累到有效濃度，造成對抗菌藥物耐藥程

9、度普遍提高。,五、細菌菌膜形成,指細菌粘附在固體或有機腔道表面，形成為微菌落，并分泌多糖蛋白復合物將自身包裹其中而形成膜狀物，可阻止藥物作用于細菌。,4種主要耐藥機制,泵出,失活,滲透障礙,靶位改變,主要耐藥機制,? β- 內酰胺酶,? 最主要的耐藥因素? 對β-內酰胺抗生素造成威脅,β-內酰胺酶的種類,A組β-內酰胺酶 （青霉素酶） [ESBLs]絲氨酸β-內

10、酰胺酶 D組β-內酰胺酶 （苯唑西林酶） C組β-內酰胺酶 （頭孢菌素酶）[AmpC]金屬β-內酰胺酶 B組β-內酰胺酶

11、（碳青霉烯酶）[IMP-1],,,重要的β－內酰胺酶,廣譜酶：TEM-1,2， SHV-1超廣譜酶： ESBLs (TEM-3 to TEM-100;SHV-2 to SHV-36; CTX-M type ESBLs)高產C類頭孢菌素酶：AmpC,廣譜酶，導致大腸埃希菌和克雷伯菌對氨芐西林，頭孢唑林和哌拉西林耐藥,產β-內酰胺酶菌株藥敏試驗的特點,可水解青霉素和半合成青霉素以及第一代、第二代頭孢菌素，多數(shù)可被酶制劑所抑制對第三代

12、、第四代頭孢菌素、碳青霉烯類以及酶抑制劑復方制劑均高度敏感。,超廣譜β－內酰胺酶是質粒介導的能夠水解頭孢他啶、頭孢噻肟等亞氨基β-內酰胺類及氨曲南等單環(huán)酰胺類抗生素，并可被克拉維酸等β-內酰胺酶抑制劑所抑制的一類β-內酰胺酶。,產ESBLs菌株的藥敏試驗特點,ESBLs菌株：主要為大腸埃希氏和肺炎克雷伯菌?？伤飧鞣Nβ-內酰胺類抗生素包括第三代的頭孢他定、頭孢噻肟、頭孢曲松和氨曲南等含氧亞氨基側鏈的頭孢菌素多數(shù)可被酶抑制劑所抑制對

13、碳青霉烯類高度敏感，對頭霉素類、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦等復方制劑多數(shù)呈敏感。,,ESBLs總陽性率為40.3%，以重癥監(jiān)護病房為最高（75.0%）。產ESBLs菌對頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松的耐藥性高達82.9%～100.0%，較不產ESBLs菌高77.0%～94.0%。對氨基糖苷類、氟喹諾酮類、磺胺類的交叉耐藥性最高分別達到96.3%、85.2%、92.6%，所有受試菌對亞胺培南均敏感。大腸埃希菌對阿米卡星耐藥率較肺炎

14、克雷伯菌低。,AmpC ß-內酰胺酶,與ESBLs 在結構上不同能水解第三代頭孢菌素可水解頭霉素類(如頭孢西丁、頭孢替坦、頭孢美唑),產AmpC酶菌株的藥敏試驗特點,產生菌：腸桿菌屬、普羅威登菌屬、摩根菌屬、弗勞地枸櫞酸桿菌、沙雷菌屬和綠膿桿菌對頭霉素類、第三代頭孢菌素和酶抑制劑復方制劑耐藥、同時對喹諾酮類和氨基糖苷類耐藥對第四代頭孢菌素頭孢吡肟和碳青霉烯類敏感如為ESBLs+AmpC酶株第四代頭孢菌素亦耐藥,碳青酶

15、烯水解酶,能夠水解亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯類抗菌藥物的β-內酰胺酶 有3類：A類獲得性碳青霉烯水解酶（2f群）OXA 23-27金屬酶,產碳青霉烯酶菌株的藥敏試驗特點,產生菌：銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、部分腸桿菌科細菌可水解各種廣譜β-內酰胺類抗生素包括第三代、第四代頭孢菌素和酶抑制劑復方制劑，頭霉素類、碳青霉烯類等多為泛耐藥菌株，并同時對喹諾酮類和氨基糖苷類耐藥。,腸桿菌科細菌,大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌

16、和奇異變形桿菌中凡ESBLs產生菌株增加了對碳青霉烯酶的檢測的要求腸桿菌科細菌如產生碳青霉烯酶，即使體外敏感，也可能臨床使用碳青霉烯類治療時失敗。,KPC(肺克)碳青霉烯酶,可水解碳青霉烯類、青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南等抗生素，能被克拉維酸抑制1966年首先在美國北卡羅來納的肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)KPC-1、此后在世界各國相繼發(fā)現(xiàn)KPC-2-4，幷涉及沙門菌、產酸克雷伯菌、陰溝、產氣及其他腸桿菌科細菌,耐藥細菌及酶類的檢測 β-內

17、酰胺酶的檢測 MRSA的檢測 耐青霉素肺炎球菌的檢測 VISA與VRSA的檢測 如何檢測KPC酶,β-內酰胺酶的檢測,頭孢硝噻吩法原理：頭孢硝噻吩的β-內酰胺環(huán)受β-內酰胺酶的作用開環(huán)后，產生由黃色向紅色轉變的顏色反應，即為產酶菌株。方法：1.用滴管吸取頭孢硝噻吩液1滴直接置于測試菌的菌落上，觀察菌落及周圍培養(yǎng)基顏色變化，產生紅色者即為產酶陽性。2.紙片法：用1 滴無菌水將頭孢硝噻吩紙片濕潤，把測試菌直接涂于經濕

18、潤后的頭孢硝噻吩紙片，即可觀察其顏色反應，產生紅色者為產酶陽性。,頭孢硝噻吩法,測定菌：葡萄球菌、腸球菌、嗜血桿菌屬、淋病奈瑟菌屬、卡他莫拉菌屬產生β-內酰胺酶特點：簡便、快速、靈敏，但價格相對較昂貴。,紙片法,,ESBL確證試驗,1.紙片擴散法 將CAZ、CD02(頭孢他啶/克拉維酸)，CTX、CD03(頭孢噻肟/克拉維酸)兩組紙片對細菌進行藥敏試驗，當CD02或CD03任意復方制劑的抑菌圈直徑與相應單藥抑菌圈直徑相差≥

19、5mm，即可判斷該菌產ESBL原理：因細菌產生的ESBL活性被CD02或CD03中的克拉維酸所抑制，CAZ或CTX可恢復抗菌活性,2.MIC測定,⑴.稀釋法菌液配置：肉湯稀釋法菌液稀釋濃度為105CFU/ml 瓊脂稀釋法菌液濃度104 CFU/ml,,,,,,,Etest試條模板的應用,Etest 試條放置瓊脂表面時有MIC 刻度面須朝上，勿將試條倒置，一旦放下，切勿再移動試條。放置時試條柄端（標有字母E）應盡可能靠近平皿邊

20、緣。如果不小心將試條刻度面朝下即MIC 刻度面與瓊脂貼合，則從柄端提起試條反轉過來再貼在瓊脂上，使刻度面朝上。,Etest試條模板的應用,作苛養(yǎng)菌或極敏感菌株藥敏時，150mm 平皿上只能放置4 ~ 5 個試條，90mm平皿只放1個試條。將試條放置平板上的方法有用鑷子，Etest 加樣器或真空筆。如果試條放到非正常位置，勿移動試條，維持原狀判讀結果。,,,4.MIC--自動儀器 5.分子生物學試驗,MRSA的檢測,

21、48633;紙片擴散法􀀹MIC（自動儀器）􀀹苯唑西林-鹽篩選平板􀀹基因：mecA􀀹基因產物：PBP2a,目前G＋球菌的主要耐藥問題,葡萄球菌中最主要的問題是MRSA，耐藥性高，致病力強，引起全身感染病死率可高達50％！MRSA應報告對所有β-內酰胺類抗菌藥物耐藥，常表現(xiàn)出同時對如氨基糖甙類、喹諾酮類及大環(huán)內酯類等多種抗菌藥物耐藥，糖肽類抗菌藥物（如萬古霉素

22、）成為臨床治療的唯一選擇，在大量應用的選擇壓力下必將出現(xiàn)對萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌，雖然迄今我國尚未發(fā)現(xiàn)，但在其他國家已有多例報道。,MRSA耐藥的機理,金黃色葡萄球菌有4種青霉素結合蛋白（PBP）PBP1， PBP2， PBP3， PBP4MRSA 的發(fā)生是因為產生了除上述4種PBP外變異的PBP2a，PBP2a與青霉素等ß-內酰胺類抗菌藥物親和力低，不能有效結合,MRSA的檢測,1. 4%NaCl-6ug/ml苯唑西

23、林鹽平板 培養(yǎng)條件：35℃，18~24h 結果：＞1個菌落生長，判為甲氧西林耐藥菌株2. 苯唑西林紙片法：10ug/片 金葡菌：11-12mm 凝固酶陰性葡萄球菌：≤17mm3. 頭孢西丁紙片法：30ug/片 金黃色葡萄球菌： ≤21 凝固酶陰性葡萄球菌：≤24mm目前CLSI規(guī)定：用頭孢西丁代替苯唑西林進行檢測,VRE（耐萬古霉素腸球菌）檢測,萬古霉素紙片擴散法 含量：3

24、0ug/片 結果：透射光，抑菌圈內出現(xiàn)薄霧狀或任何其他生長或抑菌圈≤14mm均表示耐藥 抑菌圈15-16mm為中度敏感 抑菌圈≥17mm為敏感萬古霉素耐藥確證試驗 含6ug/ml萬古霉素的M-H平板 0.5麥氏單位菌液 35 ℃，24h ≥1個菌落即判定為耐藥分子生物學方法：VanA、VanB、VanC等基因,耐青霉素肺炎球菌的檢測,苯唑西林：1ug/片抑菌圈直

25、徑≥20mm為青霉素敏感株抑菌圈直徑≤ 19mm為青霉素中敏或耐藥株，必須進行青霉素MIC測定。 MIC ≤0.06 ug/ml S（pssp) 0.125-1 ug/ml I (pisp) ≥2 ug/ml R (prsp),如何檢測KPC酶,產KPC酶的菌株用常規(guī)藥敏試驗不易檢出CLSI關于碳青霉稀類的判斷標準：MIC 厄他培南≤ 2ug/ml 亞胺培南、美羅

26、培南≤ 4ug/mlMIC 2ug/ml或4ug/ml的菌株仍可判斷為敏感注意：在常規(guī)藥敏試驗中如遇第三、第四代頭孢菌素以及其他的-內酰胺酶耐藥的菌株均應該進行測定碳青霉稀類的對這些菌株的MIC 。,檢測KPC酶的最佳底物,厄他培南是檢測KPC酶的最佳底物。如MIC為2μg/ml應視作有產KPC酶和其他碳青酶霉烯酶的可能。這時應與臨床醫(yī)師聯(lián)系，并將該菌株送往參考試驗室作進一步的研究。,檢測KPC酶,幾種高度耐藥菌感染的抗菌藥選用