志賀菌屬細菌耐藥相關質粒的耐藥性研究.pdf

1、細菌耐藥,是指細菌能在殺死它們或削弱它們的藥物中獲得生存的本能。細菌耐藥性的來源有兩個途徑。即自身基因突變和耐藥基因的獲得。外源性耐藥基因的獲取,是細菌耐藥性廣泛散播的主要原因,一般通過可移動遺傳元件完成,如質粒、轉座子、整合子、插入序列共同區(qū)(ISCR)等。質粒是一種獨立的、可自我復制的遺傳元件,自身可攜帶耐藥基因,亦可作為其他可移動遺傳元件的載體,介導菌株間基因水平轉移,在耐藥基因的擴散過程中扮演著關鍵角色。因此研究質粒DNA的結構

2、,分析質粒所攜帶的功能基因及質粒與細菌耐藥性的關系,對細菌耐藥分子機制的深入研究具有重要意義。為了系統(tǒng)研究基因的水平轉移,本課題組已選用對抗生素敏感的一株福氏志賀菌Z23作為受體菌,以臨床分離的耐多藥大腸桿茼E667為供體菌,通過接合轉移實驗構建了多重耐藥轉移菌株ZT,并通過抑制性消減雜交實驗篩選出一部分序列,斑點雜交試驗結果表明這些序列在供體菌及轉移菌株的質粒上均存在,克隆轉化實驗發(fā)現(xiàn)這些序列與細菌耐藥有關(故之后稱這些序列為耐藥相關

3、序列)。但是含有這些耐藥相關序列的質粒是否為耐藥質粒,是否為接合質粒,介導供體菌和受體菌之間耐藥性的傳遞,仍需進一步驗證。
　　 目的：通過轉化實驗獲得含有該質粒的轉化子,分析該質粒與耐藥性的關系,對該質粒上的耐藥基因進行篩選,檢測該質粒上所存在的與耐藥相關的可移動遺傳元件,以探索該質粒在耐藥過程中所起的作用及其耐藥機制,為更全面的了解質粒所介導的耐藥分予機制提供基礎資料。
　　 方法：⑴陽性克隆的獲得：通過改進分子克隆

4、上面的質粒轉化實驗方法,降低預培養(yǎng)轉速、預培養(yǎng)溫度及延長預培養(yǎng)時間,將實驗室儲存的志賀菌屬細菌質粒(該質粒來源于通過接合轉移實驗獲得的耐多藥的志賀菌屬轉移株ZT,供體菌為臨床分離的耐多藥的大腸桿菌E667,受體菌為敏感的福氏志賀菌Z23)轉入感受態(tài)大腸桿菌DH-5α中,分別涂布在含單一抗生素的培養(yǎng)基上,抗生素包括頭孢噻吩(CF)、磺胺甲嗯唑(SMZ)、諾氟沙星(NOR)、慶大霉素(GM),濃度分別為最小抑菌濃度(MIC)、1/2最小抑菌

5、濃度(1/2MIC),過夜培養(yǎng)18h-24h后,挑取板上的單克隆,進行菌落PCR擴增耐藥相關序列T2G6(本課題組前期研究篩選的位于質粒上的耐藥相關序列之一),以篩選陽性克隆。⑵質粒提取：將陽性克隆挑至含NOR的LB液體培養(yǎng)基中,過夜培養(yǎng),通過離心收集菌體,進而使用Axygen生物公司的質粒小量提取試劑盒提取質粒,然后在0.5％的瓊脂糖凝膠上與原質粒進行電泳比對。⑶藥物敏感試驗：以紙片法抗菌藥敏試驗標準及美國國立臨床實驗室標準委員會(N

6、CCLS)指南為參照,采用Kin-Bauer紙片瓊脂擴散法進行藥敏鑒定,抗生素藥敏紙片包括:頭孢噻吩(CF)、頭孢唑啉(CFZ)、頭孢呋辛鈉(CXM)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢他啶/克拉維酸(CAZL)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTXL)、頭孢唑肟(ZOX)、頭孢哌酮(CFP)、氨曲南(AZT)、磺胺甲惡唑(SMZ)、甲氧芐啶(TMP)、諾氟沙星(NOR)、阿莫西林(AMX)、氨芐兩林(AMP)、氯霉

7、素(CHL)、四環(huán)素(TET)、鏈霉素(STR)、慶大霉素(GM)、亞胺培南(IPM)等。所用質{空菌株為大腸桿菌ATCC25922。⑷耐藥基因篩選：根據藥敏結果參考相關文獻設計引物篩選質粒上可能存在的耐藥相關基因:喹諾酮類耐藥相關基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、aac(6')-Ib-cr,頭孢菌素類耐藥相關基因blaTEM、blaSHV、blaCTX、Ampe,磺胺耐藥基因sul1及氯霉素乙酰轉移酶基因

8、cat等的引物,PCR相關基因,并將獲得的PCR產物送至生物公司測序鑒定,經BLAST比對后對基因進行確認。⑸耐藥相關的可移動遺傳元件的篩選：參考相關文獻設計引物篩選質粒上可能存在的可移動遺傳元件相關基因,包括插入序列ISEcpl、IS26、IS903、ISCR1;整合酶基囚intI1、intI2及intI3:接合質粒遺傳標記traA、trbC。PCR相關基因,并將獲得的PCR產物送至生物公司測序鑒定,經BLAST比對后對基因進行確認。

9、
　　 結果：①質粒鑒定：通過對抗生素培養(yǎng)板上的單克隆進行茵落PCR耐藥相關序列T2G6,在含NOR(1/2MIC)的LB固體培養(yǎng)基上獲得陽性克隆;質粒凝膠電泳比對結果顯示轉化子質粒即為所轉化的志賀菌屬細菌質粒。②藥敏鑒定：感受態(tài)大腸桿菌對所有的抗生素敏感,轉化子對CAZ、AZT耐藥,對CTX、ZOX中介耐藥,對其他抗生素則敏感。轉化子與感受態(tài)大腸桿菌相比:CTX、CFP、ZOX、FEP、NOR、CIP、LVF、SMZ、TMP、

10、CHL的抑菌環(huán)直徑減小5mm以上:CFZ、CXM、AMP、AMX、GM、STR、TET、IPM抑菌環(huán)直徑的變化在5mm內。ESBLs確證實驗表明該轉化子為非產ESBLs菌株。③耐藥基因的篩選：該質粒上存在耐藥基因TEM-116、sull及cat,未檢測到喹諾酮類抗生素耐藥相關基因。④耐藥相關可移動遺傳元件的篩選：1類整合子酶基因檢測陽性;接合質粒遺傳標記trbC篩選陽性;未檢測到插入序列ISEcp1、IS26、IS903、ISCR1的存