志賀菌臨床株耐藥性分析及對氟喹諾酮類抗生素耐藥機制的研究.pdf

1、志賀菌是細菌性痢疾(簡稱菌痢)的病原體，從發(fā)現(xiàn)至今已有百余年的歷史。志賀菌感染目前仍是全球影響公共衛(wèi)生健康的重要問題。在中國，細菌性痢疾每年的發(fā)病數(shù)接近50萬，發(fā)病率居37種監(jiān)測感染性疾病的前幾位，對公眾健康造成嚴重威脅?？股貞糜诩毦粤〖驳闹委熞院?，耐藥率逐年上升。上世紀七十年代喹諾酮類藥物開始應用于臨床并且已成為當前治療細菌性痢疾的首選用藥。但是，隨著該類藥物的廣泛應用，近年來耐藥問題日益嚴重。
　　研究目的：為了解天津地

2、區(qū)近三年來志賀菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥情況及探討對氟喹諾酮的耐藥機制，本課題選取2009年-2011年天津地區(qū)三家三級甲等醫(yī)院腸道門診分離的志賀菌臨床株，進行血清學分型及抗生素藥敏試驗，并對氟喹諾酮耐藥株從染色體靶位酶基因突變及質粒介導兩個方面探討其對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制。
　　材料與方法：收集白天津市三家三級甲等醫(yī)院2009年、2010年及2011年5月-9月腸道門診患者糞便標本的志賀菌臨床株139株，采用血清凝集法鑒定其

3、血清學分群及分型，明確本地區(qū)優(yōu)勢流行血清型。采用K-B紙片擴散法用17種臨床常用抗生素進行藥敏試驗，分析并比較志賀菌不同血清群對不同抗菌藥物的耐藥程度。其中采用環(huán)丙沙星、左氧氟沙星等4種抗生素篩選氟喹諾酮類耐藥株，并通過PCR擴增技術對氟喹諾酮耐藥志賀菌的gyrA、parC基因及所有菌株的qnrA、qnrB、qnrS、aac(6’)-Ib-cr、qepA基因進行擴增、測序，測序結果在Genebank上進行比對。將PMQR基因陽性菌株與大

4、腸埃希菌J53 ARZ進行質粒接合實驗，采用微量肉湯稀釋法比較受體菌對抗菌藥物的敏感性變化。對供體菌、受體菌及接合菌提取質粒，進行質粒圖譜分析及特異性PCR擴增確認含PMQR基因質粒成功導入受體菌。
　　實驗結果：1、經(jīng)常規(guī)生化及血清凝集實驗證實，139株志賀菌包括福氏志賀菌17株(包括1a、2a、2b、4、5b、6及X、Y變種)，宋內志賀菌121株及鮑氏志賀菌1株。天津地區(qū)近三年志賀菌主要流行血清群為宋內志賀菌，其次為福氏志賀菌

5、F2a。藥敏結果顯示：139株志賀菌對一代喹諾酮萘啶酸敏感率最低，為1.44％，其次是氨芐西林、復方磺胺甲噁唑和鏈霉素，敏感率分別為2.22％、3.59％及4.32％，3種及3種以上抗生素多重耐藥菌株接近98％。福氏志賀菌與宋內志賀菌對多種抗生素耐藥程度存在差異，對氟喹諾酮及三代頭孢耐藥程度明顯高于宋內志賀菌。
　　2，本研究總共篩選出氟喹諾酮耐藥志賀菌5株，均為福氏志賀菌，耐藥率為3.59％(5/139)。宋內志賀菌無氟喹諾酮耐

6、藥菌，但對萘啶酸耐藥程度較高。5株氟喹諾酮耐藥菌耐藥程度均較高，其中2株對左氧氟沙星同時耐藥。耐藥菌在gyrA、parC基因均有突變且突變基因及位點具有多態(tài)性，突變株中均有gyrA83(Ser→Leu)及parC80(Ser→Ile)位點突變，其中左氧氟沙星耐藥株N8與其余4株菌相比缺乏gyrA基因87位點突變，其余4株菌均同時存在 gyrA87(Asp→Gly、Asn)位點突變。139株志賀菌中共檢出4株PMOR基因陽性株，1株qnr

7、S1陽性菌N8為福氏志賀菌，對氟喹諾酮耐藥；3株aac(6’)-Ib-cr基因陽性菌均為宋內志賀菌，對氟喹諾酮敏感。通過質粒接合實驗獲得3株接合株，提取質粒后發(fā)現(xiàn)大小約10kb的質粒從供體菌轉移到受體菌中，提取接合菌DNA均擴增出了相應PMQR基因，藥敏結果顯示qnrS1及aac(6’)-Ib-cr基因分別使受體菌在質粒接合前后對環(huán)丙沙星和諾氟沙星的MIC分別提高了16、8和4、4個稀釋度，對左氧氟沙星和氧氟沙星的MIC分別提高了16、

8、8和1、4個稀釋度，但都達不到臨床意義的耐藥臨界值。進一步印證了PMQR基因介導低水平耐藥的推斷，并提示qnr介導喹諾酮耐藥程度要高于aac(6’)-Ib-cr。
　　實驗結論：本地區(qū)近3年志賀菌主要流行血清群為宋內志賀菌，其次為福氏志賀菌F2a。志賀菌對多種抗生素耐藥率較高，且多重耐藥菌株比例高。福氏志賀菌與宋內志賀菌對多種抗生素耐藥程度存在差異，對氟喹諾酮及三代頭孢耐藥程度明顯高于宋內志賀菌。對氟喹諾酮類藥物耐藥率低于5％，且