小鼠腸道菌群及肺炎克雷伯菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥性研究.pdf

1、背景及目的：近年來,以大腸埃希氏菌(Escherichia coli,E.Coli)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,Kpn)為代表的腸桿菌科細(xì)菌對(duì)氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones,FQS)耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重。研究大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯桿菌對(duì)FQS耐藥機(jī)制,對(duì)控制耐藥性的產(chǎn)生和發(fā)展,合理應(yīng)用抗菌藥物具有重要意義。為此,本文就這兩種細(xì)菌耐藥性的獲得進(jìn)行了部分抗菌藥物的體外實(shí)驗(yàn)研究,并對(duì)誘導(dǎo)成功的肺

2、炎克雷伯菌耐藥基因gyrA和parC進(jìn)行PCR擴(kuò)增和部分耐藥菌株DNA測(cè)序。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)M臨床用藥方式,觀察加替沙星正規(guī)用藥和非正規(guī)用藥方式對(duì)小鼠腸道菌群的影響。
　　方法：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用24只清潔級(jí)昆明小鼠,隨機(jī)分為3組,每組8只,對(duì)照組只灌胃生理鹽水,另外兩組按正規(guī)用藥和非正規(guī)用藥給小鼠灌胃加替沙星溶液,7天后無菌采取小鼠糞便培養(yǎng),觀察各組小鼠糞便中雙歧桿菌,類桿菌,乳酸桿菌,大腸桿菌及腸球菌數(shù)量。同時(shí)直接涂片做革蘭氏染色查菌。用

3、表型確認(rèn)法對(duì)大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌鑒定到種。用確證試驗(yàn)對(duì)119株大腸埃希菌和73株肺炎克雷伯菌做ESBLs檢測(cè),K-B法做藥敏試驗(yàn)。然后用瓊脂二倍稀釋法測(cè)定環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和加替沙星對(duì)兩種細(xì)菌的最小抑菌濃度。依據(jù)細(xì)菌鑒定及MIC結(jié)果最終選擇15株大腸埃希菌和10株肺炎克雷伯菌作為實(shí)驗(yàn)菌株,分別編入環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和加替沙星誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組。同時(shí)用大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603作為質(zhì)控菌株。對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)

4、行體外多步法誘導(dǎo)性耐藥試驗(yàn)。具體步驟如下①將試驗(yàn)菌株接種于麥康凱平板,18h~24h培養(yǎng)后,取純菌落2~3個(gè)用滅菌生理鹽水先配成0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?再稀釋成10~7CFU/ml。取10μl的菌懸液接種于2ml含1/4 MIC抗菌藥物濃度的MH肉湯中,使其最終細(xì)菌接種量為5×10~4CFU/ml。②35℃培養(yǎng)24h,如果有細(xì)菌生長(zhǎng),用24h的細(xì)菌培養(yǎng)物用滅菌生理鹽水稀釋制備1×10~7CFU/ml的菌懸液,取10μl的菌懸液接種于2ml含1

5、/2MIC抗菌藥物濃度的MH肉湯中,35℃培養(yǎng)24h。③同上步驟,將細(xì)菌接種于含抗菌藥物濃度逐步增高的MH肉湯中培養(yǎng),如有細(xì)菌生長(zhǎng),直至含抗菌藥物濃度128μg/ml,將誘導(dǎo)的耐藥菌株接種在不含抗菌藥物的MH肉湯中35℃培養(yǎng),每24h轉(zhuǎn)種一次,連續(xù)傳代5次。然后轉(zhuǎn)入含抗菌藥物濃度128μg/ml的肉湯,最后轉(zhuǎn)種于麥康凱平板看有無細(xì)菌生長(zhǎng)。革蘭氏染色及生化實(shí)驗(yàn)重新鑒定菌株。從麥康凱平板挑取典型菌落用瓊脂二倍稀釋法測(cè)定環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和

6、加替沙星對(duì)這兩種菌的MIC。用PCR擴(kuò)增誘導(dǎo)菌株耐藥基因gyrA和parC并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析。
　　結(jié)果：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加替沙星灌胃7天后小鼠腸道菌群失調(diào),與給藥前相比,大腸埃希菌和腸球菌藥敏結(jié)果無明顯變化。灌胃前后大腸埃希菌對(duì)CIP、LEV、GAT、AM、CRO、AMK、NOR較敏感,腸球菌對(duì)AM、LEV、VA、GAT較敏感,對(duì)NOR、CIP、CRO敏感性不同。兩種用藥方式可導(dǎo)致大腸埃希菌數(shù)量顯著減少(P<0.05),腸球菌數(shù)量稍有增

7、加(P>0.05)。而雙歧桿菌,乳酸桿菌和類桿菌數(shù)量無明顯變化(P>0.05)。119株大腸埃希菌檢出產(chǎn)ESBLs54株,陽性率45.4％。73株肺炎克雷伯菌檢出產(chǎn)ESBLs36株,陽性率49.3％。產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)抗生素的耐藥率顯著高于非產(chǎn)ESBLs菌株。本實(shí)驗(yàn)環(huán)丙沙星誘導(dǎo)組中10株E.coli為敏感菌株(MIC≤1μg/ml),2株E.coli為中介耐藥菌株(MIC=2μg/ml),3株E.coli為耐藥菌株(MIC≥4μg/ml

8、),這15株E.coli經(jīng)環(huán)丙沙星誘導(dǎo)成13株高耐環(huán)丙沙星菌株(MIC≥128μg/ml)。左氧氟沙星誘導(dǎo)組和加替沙星誘導(dǎo)組中有10株E.coli為敏感菌株(MIC≤2μg/ml),3株E.coli為中介菌株(MIC=4μg/ml),2株E.coli為耐藥菌株(MIC≥18μg/ml),15株E.coli經(jīng)左氧氟沙星和加替沙星分別誘導(dǎo)成8株和5株高度菌株(MIC≥128μg/ml)。每組10株Kpn經(jīng)環(huán)丙沙星誘導(dǎo)成8株高耐環(huán)丙沙星菌株。

9、經(jīng)左氧氟沙星誘導(dǎo)成7株高耐左氧氟沙星菌株。經(jīng)加替沙星誘導(dǎo)成4株高耐加替沙星菌株。六組細(xì)菌誘導(dǎo)后MIC均達(dá)到128μg/ml以上,MIC值比誘導(dǎo)前增加16-16410倍。經(jīng)一種藥物誘導(dǎo)耐藥后對(duì)另外兩種藥物MIC也增加8-8205倍。此結(jié)果證明了大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌是逐步耐藥的進(jìn)程。本研究DNA序列顯示8株Kpn中的gyrA基因均有突變,第83位氨基酸的密碼子發(fā)生了(TCC→ATC/TTC/TAC)的突變,引起了相應(yīng)氨基酸的改變(Ser

10、-83→Ile/Phe/Tyr)。其中有4株同時(shí)出現(xiàn)了第87位點(diǎn)(GAC→GAA/GCC)的改變,氨基酸也由Asp-87→Glu/Ala。有5株parC出現(xiàn)了第80位氨基酸密碼子點(diǎn)突變(AGC→ATC),引起氨基酸由Ser→Ile的改變。而這5株同時(shí)有g(shù)yrA變異,這說明gyrA變異合并有parC變異,其對(duì)FQS的耐藥性會(huì)增強(qiáng)。在本研究中只發(fā)現(xiàn)parC變異有絲氨酸Ser80(AGC)→異亮氨酸Ile(ATC),未發(fā)現(xiàn)其他變異。