鼠傷寒沙門菌分離株耐藥性和其質(zhì)粒介導耐藥基因研究.pdf

1、鼠傷寒沙門菌是一種重要的人獸共患病原菌，特別在歐美等發(fā)達國家?guī)缀趺磕甓加猩⒃诒┌l(fā)的報道。鼠傷寒沙門菌來源廣泛，可在人和動物之間通過食物鏈發(fā)生交叉感染?？咕幬锏氖褂檬欠乐紊抽T菌病的重要措施，但由于其不合理使用導致耐藥菌株不斷出現(xiàn)，耐藥性不斷增強，并出現(xiàn)多重耐藥的現(xiàn)象。此外，耐藥基因的傳播也是耐藥菌株不斷出現(xiàn)的原因之一。耐藥基因通常位于可移動元件上，攜帶耐藥決定因子的質(zhì)粒是傳播耐藥性的重要因素。由此帶來的耐藥問題、食品安全問題也越來越嚴重

2、。而目前國內(nèi)關(guān)于鼠傷寒沙門菌耐藥分布情況及其質(zhì)粒介導耐藥基因的研究相對較少。
　　本研究以330株鼠傷寒沙門菌為研究對象，通過測定這些菌株對18種抗菌藥物的最小抑菌濃度，分析不同來源的鼠傷寒沙門菌耐藥特性和多重耐藥狀況;調(diào)查質(zhì)粒介導的喹諾酮類藥物耐藥基因(PMQR)在鼠傷寒沙門菌中的流行和分布情況;通過質(zhì)粒接合試驗獲得新型多粘菌素耐藥基因mcr-1陽性接合子，并對供受體菌及接合子進行氨基糖苷類、喹諾酮類、苯丙醇類、β-內(nèi)酰胺類、磺

3、胺類、硝基呋喃類、喹噁啉類、四環(huán)素類藥物的敏感性試驗，測定其對各種抗菌藥物的影響。本研究將有助于進一步了解鼠傷寒沙門菌分離株耐藥流行狀況、耐藥特點及其質(zhì)粒介導耐藥基因的分布。
　　1.不同來源鼠傷寒沙門菌分離株耐藥性測定與分析
　　本研究對330株不同來源的鼠傷寒沙門菌最小抑菌濃度(MIC)進行測定，結(jié)果顯示其對阿莫西林/克拉維酸的耐藥率最高，達到75.8％，其次為四環(huán)素(73.9％)、氨芐西林(73.6％);對鏈霉素、氯霉

4、素、頭孢唑啉、萘啶酸、復方新諾明和多粘菌素E的耐藥率均在50％以上;對氨曲南、卡那霉素、慶大霉素、恩諾沙星和喹乙醇的耐藥率分布在20.1％-38.8％之間;環(huán)丙沙星和呋喃妥因的體外抑菌效果較好，耐藥率均未達到10％;而美羅培南和阿米卡星的體外抑菌效果最好，幾乎沒有耐藥菌株出現(xiàn)。
　　鼠傷寒沙門菌分離株主要來源于養(yǎng)殖環(huán)節(jié)（豬場）、屠宰環(huán)節(jié)（屠宰場）、市場環(huán)節(jié)（農(nóng)貿(mào)市場）和人，因此對各個環(huán)節(jié)鼠傷寒沙門菌耐藥性進行研究。結(jié)果顯示不同環(huán)節(jié)

5、的鼠傷寒沙門菌對阿莫西林/克拉維酸、四環(huán)素、氨芐西林、氯霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星、阿米卡星、美羅培南和呋喃妥因的耐藥性相似。而對余下的8種抗菌藥物，其耐藥性表現(xiàn)差異較大。對于同一個環(huán)節(jié)而言，鼠傷寒沙門菌對各抗菌藥物的耐藥性與本研究中菌株的總體耐藥情況較為相似，其中養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中鼠傷寒沙門菌的耐藥率較其他三個環(huán)節(jié)都高，其次是市場環(huán)節(jié)，屠宰環(huán)節(jié)菌株的耐藥率與人源菌株較為相似。
　　鼠傷寒沙門菌多重耐藥現(xiàn)象較為普遍。其中有260株分離株對3

6、類及以上抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性，多重耐藥率達83.9％(260/310)。多重耐藥的優(yōu)勢表型為氨芐西林-可莫西林/克拉維酸-鏈霉素-四環(huán)素-復方新諾明-氯霉素-多粘菌素E。市場銷售環(huán)節(jié)中鼠傷寒沙門菌多重耐藥現(xiàn)象最為嚴重(100％)，養(yǎng)殖和人環(huán)節(jié)次之，多重耐藥率分別為99.0％和76.1％，屠宰環(huán)節(jié)多重耐藥率最低為72.3％。
　　對2014-2016年間在定點豬場收集的鼠傷寒沙門菌進行耐藥性監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，定點豬場鼠傷寒沙門菌對各抗菌藥物

7、的MICmm、MIC50值要普遍高于本研究中鼠傷寒沙門菌總體統(tǒng)計狀況，說明該定點豬場中鼠傷寒沙門菌在這段時間耐藥現(xiàn)象較為嚴重。
　　2.鼠傷寒沙門菌分離株中PMQR基因的流行和分布情況
　　本研究對330株不同源鼠傷寒沙門菌中PMQR基因進行檢測，PMQR基因的陽性率高達51.2％。在所有的PMQR基因中，oqxAB陽性率最高，為29.7％; aac(6')-Ⅰb-cr和qnrS的陽性率次之（19.4％和10.9％），未檢測

8、到qnrA、qnrC和qnrD基因。oqxAB的陽性率顯著高于其它PMQR基因，尤其是在豬源分離株中。
　　通過對qnr基因陽性菌株進行測序，確定了其基因亞型。在本研究中，共測出qnrB基因亞型2種，分別為qnrB4和qnrB26; qnrS基因亞型也為2種，分別為qnrS1和qnrS2。雙陽性的菌株中qnrS+aac(6')-b-cr和oqxAB+aac(6')-b-cr共同存在的現(xiàn)象最為常見，分別占9.6％和9.9％。對PMQ

9、R陽性菌株的基因型和表型相關(guān)性分析顯示:對喹諾酮類藥物耐藥的鼠傷寒沙門菌中，攜帶有PMQR基因的菌株占73.6％;幾乎所有攜帶PMQR基因的表型敏感性菌株對環(huán)丙沙星敏感性下降（DCS，decreased ciprofloxacin susceptibility），所對應的MIC值的范圍在0.12-1μg/mL之間。oqxAB陽性菌株對喹乙醇的MIC值結(jié)果顯示，有90.0％的oqxAB陽性菌株對喹乙醇表現(xiàn)耐藥或者中介，88.6％的oqxA

10、B陰性菌株對喹乙醇表現(xiàn)敏感或者中介，說明330株鼠傷寒沙門菌的基因型與喹乙醇的耐藥表型基本對應。
　　3.鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒介導的新型多粘菌素耐藥基因mcr-1的初步研究
　　應用PCR方法對新型質(zhì)粒介導的多粘菌素耐藥基因mcr-1進行檢測，發(fā)現(xiàn)330株鼠傷寒沙門菌中，僅一株菌含有此基因。通過對該mcr-1陽性菌株的全基因組測序結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)該鼠傷寒沙門菌全長5，232，290 bp，GC含量為51.4％，多位點序列型為S

11、T34。進一步研究發(fā)現(xiàn)，該菌基因組中含有IncHI2、IncX1、IncI2、IncHI2A和IncQ1共5個復制子，提示其可能攜帶不止一個質(zhì)粒，且mcr-1基因位于其中一個質(zhì)粒上;通過質(zhì)粒接合試驗，獲得1株mcr-1陽性接合子。
　　藥物敏感性試驗結(jié)果顯示，該接合子對多粘菌素E和鏈霉素表現(xiàn)耐藥，所對應的MIC值分別為8μg/mL和64μg/mL，與受體菌相比，分別升高了16倍和64倍。接合子對環(huán)丙沙星、恩諾沙星和萘啶酸的敏感性出