7年間大腸埃希菌臨床連續(xù)分離株耐藥性變遷及質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因研究.pdf

1、目的：
　　 1.了解溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院2002～2008年間臨床分離大腸埃希菌的分布情況及耐藥特性,為臨床抗菌藥物選擇提供依據(jù)。
　　 2.研究2002～2008年每年7～10月不依賴耐藥背景的大腸埃希菌臨床連續(xù)分離株中質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因的分布與變遷情況及其與喹諾酮類抗菌藥物耐藥的相關(guān)性。
　　 3.研究質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因的多態(tài)性和遺傳變異規(guī)律。
　　 方法：
　　 1.回顧

2、性調(diào)查2002～2008年間臨床分離大腸埃希菌的臨床感染分布特點,分析大腸埃希菌的耐藥性及變遷情況。
　　 2.PCR篩選質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因(qnr,aac(6’)-Ib-cr,qepA),陽性產(chǎn)物進行DNA測序以確定基因型；接合轉(zhuǎn)移試驗探討質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因的轉(zhuǎn)移性；瓊脂稀釋法測臨床分離菌株MIC,E-test法測受體菌、接合子MIC,分析耐藥基因與耐藥性的關(guān)系。
　　 3.運用生物信息學(xué)方法分析質(zhì)粒介

3、導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因的多態(tài)性和遺傳變異規(guī)律。
　　 結(jié)果：
　　 1.本研究中514株大腸埃希菌主要來源于尿液標本,占48.4％(249/514),其次為膿液、痰液和血液等；臨床常用抗菌藥物中,敏感性最好的為亞胺培南(敏感率為99.4％),其次為哌拉西林/他唑巴坦(敏感率為87.5％)和頭孢他啶(敏感率為84％),但頭孢他啶耐藥性具明顯上升趨勢；耐藥率最高的為氨芐西林(不敏感率達94.9％),其次為復(fù)方新諾明(不敏感率為

4、76.5％)；慶大霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、頭孢曲松均處于較高耐藥水平(不敏感率均在60％以上)；ESBLs的檢出率高達57.8％。
　　 2.2002～2008年514株大腸埃希菌臨床連續(xù)分離株中,對環(huán)丙沙星的不敏感率分別為74.6％,65.4％,70.4％,79.7％,70.1％,74.7％,73.1％,對左氧氟沙星的不敏感率分別為71.4％,64.2％,70.4％,79.7％,68.8％,74.7％,73.1

5、％,從2002年開始即處于較高耐藥水平,耐藥現(xiàn)象嚴重。
　　 3.514株大腸埃希菌中共檢出qnr基因陽性菌株20株,檢出率為3.9％,其中兩株同時攜帶qnrB,qnrS基因；qnrA,qnrB,qnrS基因分別檢出2株(0.4％),6株(1.2％),14株(2.7％),；經(jīng)BLAST比對分析,基因型包括qnrS1,qnrB4,qnrB6,qnrA1；未檢出qnrC,qnrD基因。qnrA,qnrB,qnrS基因均最早在2002

6、年的標本中檢出；35％的qnr基因陽性菌株對環(huán)丙沙星敏感,最低MIC僅0.5μg/ml。接合轉(zhuǎn)移試驗成功9株,接合子對喹諾酮類藥物的MIC均有不同程度的提升,大部分呈低水平耐藥,但其中2株接合子呈現(xiàn)高水平耐藥。
　　 4.514株大腸埃希菌中,aac(6’)-Ib基因陽性菌株為253株,陽性率為49.2％,從253株aac(6’)-Ib陽性菌株中隨機選取134株進行DNA測序、BLAST比對,其中42(31.3％)株為aac(6

7、’)-Ib-cr,18株為aac(6’)-Ib的變異株,其余74株均為aac(6’)-Ib野生型。aac(6’)-Ib-cr基因最早在2002年標本中檢出；在環(huán)丙沙星敏感和耐藥菌株中,產(chǎn)和不產(chǎn)ESBLs菌株中的分布無統(tǒng)計學(xué)差異；16.7％的aac(6’)-Ib-cr基因陽性菌株對環(huán)丙沙星敏感,最低MIC僅0.03μg/ml。接合轉(zhuǎn)移試驗成功10株,接合子對環(huán)丙沙星和諾氟沙星MIC均有不同程度的提升,對左旋氧氟沙星MIC無影響。
　

8、　 5.本研究514株大腸埃希菌中未檢出qepA基因。
　　 6.基因陽性菌株中,測得的序列與GenBank中已登錄的qnr基因家族序列100％同源,不存在突變株。在測序的134株aac(6’)-Ib基因陽性菌株中,18株為aac(6’)-Ib突變株,分為6種亞型,以AF479774為參照序列,涉及到的多態(tài)位點有310,322,356,407,411,518,532,535,541bp處,所有序列均已遞交至GenBank(登錄

9、號為FJ829031,FJ829032,FJ829033,FJ829034,FJ619241,FJ619242)。aac(6’)-Ib基因存在兩個相對保守區(qū)(60～100aa,140～170aa),兩個易變異區(qū)(104～119aa,173～181aa),變異頻率最高的為119位氨基酸,其次為181位氨基酸。6種類型的突變株與aac(6’)-Ib基因親緣關(guān)系均較近。
　　 結(jié)論：
　　 1.所測514株大腸埃希菌僅對少數(shù)抗

10、菌藥物敏感性較高,對大多數(shù)抗菌藥物有較高的耐藥性,且耐藥性有上升趨勢,耐藥現(xiàn)象比較嚴重。
　　 2.我院大腸埃希菌PMQR基因以aac(6’)-Ib-cr基因為主,其次為qnr基因,qnr基因中以qnrS為主,基因亞型以qnrS1為主,其次為qnrB4、qnrB6、qnrA1。未檢出qepA基因。
　　 3.本研究首次以不考慮耐藥背景的大腸埃希菌為研究對象,證實PMQR基因在喹諾酮類耐藥和敏感菌株中均存在,喹諾酮類藥物敏