安徽省產(chǎn)質(zhì)粒介導AmpC酶大腸埃希菌的耐藥性與Ⅰ類整合子的研究.pdf

1、目的：：了解安徽省產(chǎn)質(zhì)粒介導AmpC酶大腸埃希菌對常用抗菌藥物的耐藥情況，耐藥基因型別的分布，指導臨床合理用藥。了解新酶的生化特性，等電點和酶對抗菌藥物的水解特性。了解產(chǎn)質(zhì)粒介導AmpC酶大腸埃希菌Ⅰ類整合子的流行情況，以及Ⅰ類整合子中基因盒的種類。
　　 方法：安徽省細菌耐藥監(jiān)測中心收集35所醫(yī)院2007年隨機月份住院和門診患者的各種臨床送檢標本，無重復分離的E.coli共355株。全部菌株均由Microscan WalkAw

2、ay-40全自動微生物分析儀（美國DADE公司）自動鑒定系統(tǒng)鑒定。355株大腸埃希菌通過頭孢西丁三維實驗篩選出確證高產(chǎn)AmpC酶菌株，以三維試驗陽性菌株總DNA為模板，使用blaampC通用引物進行PCR擴增以篩選出攜帶ampC基因菌株；將三維試驗陽性菌株行轉移接合試驗，行全編碼引物PCR擴增。并用瓊脂平板稀釋法測定其對13種抗菌藥物的耐藥性。對多次測序并經(jīng)GenBank比對后確定的產(chǎn)新酶菌株進行以下實驗：PCR擴增臨床分離株和/或轉移

3、接合子中的AmpC型β-內(nèi)酰胺酶編碼基因片段，PCR產(chǎn)物純化后克隆入pMD-18T載體，表達于感受態(tài)細胞大腸埃希菌JM109中，再次測定核苷酸序列，結果至GenBank比對，進行DNA序列分析。將新酶全編碼基因克隆入表達載體pHSG398，轉化于感受態(tài)細胞大腸埃希菌JM109中，用加有抗菌藥物的瓊脂平板進行轉化株篩選。用瓊脂倍比稀釋法測定臨床分離株和接合子，轉化株的MIC。采用超聲破碎法進行產(chǎn)新酶細菌轉化株的粗酶提取，進行酶促反應動力學

4、研究，以初步了解新酶的動力學特性。等電聚焦電泳測定其等電點（pI）。Southern blot實驗進一步了解新酶是否為質(zhì)粒介導。PCR篩選Ⅰ類整合酶基因，進一步檢測陽性樣本可變區(qū)基因盒序列。檢測攜帶新型AmpC型酶菌株的整合子基因盒。
　　 結果：355株大腸埃希菌中21株大腸埃希菌三維實驗陽性，占所有臨床分離菌株的5.9％(21/355)，19株經(jīng)PCR檢測攜帶ampC基因，16株轉移接合成功，經(jīng)序列分析表明，9株CIT陽性結

5、果，6株DHA陽性結果，3株EBC陽性結果；1株同時攜帶EBC及DHA。檢出一株EBC型新基因 (序列號為FJ237369)；藥敏結果顯示臨床分離菌株及接合子對多種抗菌藥物耐藥，對頭孢吡肟，亞胺培南，美羅培南敏感。產(chǎn)新型質(zhì)粒介導AmpC酶菌株的轉移接合試驗和克隆表達試驗均取得成功，其野生株及轉化株的MIC結果顯示：野生株和轉化株有著幾乎相同的耐藥譜，但轉化株對抗菌藥物的耐藥性有所下降。產(chǎn)新型質(zhì)粒介導AmpC酶細菌轉化株的等電聚焦顯示，其

6、等電點在8.6左右，Southern blot實驗提示新酶為質(zhì)粒介導。酶促反應動力學研究，初步了解新酶對5種常用抗菌藥物的Km值和Vmax值，結果顯示：該酶對頭孢西丁的水解效率最高。產(chǎn)質(zhì)粒介導AmpC酶的大腸埃希菌中16株攜帶有I類整合子，14株擴增出了可變區(qū)，經(jīng)測序基因盒為編碼磺胺類抗菌藥物耐藥的基因dhfrA17和編碼氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的基因aadA5，aadA1，aadB。ampC基因不在Ⅰ類整合子基因盒上。
　　 結