海水中大腸桿菌耐藥性及其整合子介導的耐藥基因研究.pdf

1、抗生素的廣泛和不恰當使用，使微生物特別是病原微生物，在強大的抗生素選擇壓力下，演化出許多不同的耐藥機制，導致各種病原菌的耐藥問題越來越嚴重。耐藥性可通過食物鏈或各類環(huán)境介質所傳遞，其中水環(huán)境被認為是抗性細菌和抗性基因的―儲存庫，其包括飲用水途徑或海水浴場娛樂活動。海水浴場承載了大量的游客，由于雨水沖刷或漲潮落潮引入了人源及動物源糞便，進而對浴場海水造成了環(huán)境污染。糞便通常攜帶了大量的大腸桿菌，其中致病性大腸桿菌可通過海水吞咽引發(fā)游泳人群

2、致命性腸道疾病。而隨著抗生素的廣泛使用，海水浴場中耐藥性大腸桿菌數(shù)目也逐步增加。耐藥性大腸桿菌攜帶的抗性基因可通過自身基因突變或抗性基因水平傳播在不同種屬細菌之間傳遞。因此，調查研究海水浴場大腸桿菌耐藥性具有重要的公共衛(wèi)生意義。
　　本研究在細菌耐藥性日益嚴重的現(xiàn)狀下，采用微生物及分子生物學方法，開展了對浴場抗性及抗性基因的研究工作，最終得到的主要研究內容和研究結果如下：
　　1、本研究選取大連星海浴場為代表浴場，通過藥敏實

3、驗分析了海水浴場中大腸桿菌的耐藥性狀況。對從海水中分離出的138株疑似大腸桿菌進行生理生化鑒定發(fā)現(xiàn)41株為大腸桿菌，并采用K-B紙片法測定了其對9種常見抗生素的耐藥性。藥敏實驗結果顯示，受試菌株對四環(huán)素的耐藥率高達46.3％，這跟四環(huán)素在我國使用時間早，使用領域廣泛有關，而氨曲南僅為4.9％，氨曲南的臨床使用相對較少，在藥物使用的選擇壓力下，反映為抗生素的耐藥率相對較低。星海浴場海水中大腸桿菌的耐藥率為65.9％，其中34%的大腸桿菌對

4、3種及其以上的抗生素表現(xiàn)出抗性。上述結果表明大連星海浴場中大腸桿菌的多重耐藥狀況嚴重。
　　2、以試驗菌株的基因組及質粒DNA為模板，通過對四環(huán)素抗性基因PCR檢測，實驗結果中四環(huán)素陽性菌株表現(xiàn)出耐藥性的比率分別為68％和84％，均較高，將四環(huán)素陽性菌株數(shù)與四環(huán)素耐藥菌株數(shù)進行χ2檢驗，發(fā)現(xiàn)四環(huán)素陽性菌株中的耐四環(huán)素菌株數(shù)顯著高于四環(huán)素陰性菌株，表明大腸桿菌的四環(huán)素耐藥性與四環(huán)素抗性基因陽性檢出率相關。其中四環(huán)素抗性基因tetA的

5、檢出率最高，其次tetB，其它四環(huán)素抗性基因未檢出。推測大腸桿菌耐藥性，可能主要由tetA基因傳遞。實驗中檢測到部分四環(huán)素敏感菌株亦含有抗性基因，推測其可能原因為其攜帶但未表達。
　　3、本研究中41株分離自星海浴場水樣中的大腸桿菌，整合酶基因檢測PCR結果中，41株分離菌株中，有14株為多重耐藥菌株，多重耐藥率為34％，至少對三種抗生素耐藥的整合酶陽性菌株均占比例較高，分別為83.3％和80％。將整合子陽性菌株數(shù)與多重耐藥菌株數(shù)

6、進行χ2檢驗，發(fā)現(xiàn)整合子陽性菌株的多重耐藥率顯著高于整合子陰性菌株，表明大腸桿菌的多重耐藥性與整合子陽性檢出率相關。單個菌株攜帶的耐藥基因與耐藥表型之間并無完全對應關系，但整合子在耐藥菌株之間的分布相對來說比較集中。
　　4、整合子可變區(qū)擴增結果中，整合酶基因的PCR擴增陽性率比整合子可變區(qū)的PCR擴增陽性率高。分析原因可能是整合子的5′或3′端保守序列中有大的插入序列，造成5’CS或3’CD引物相應序列的缺失，不能得到擴增引物。

7、整合子可變區(qū)測序結果顯示整合子內部插入磺胺類耐藥基因二氫葉酸還原酶基(dfrAl/12/17)和氨基糖苷類耐藥基因核苷轉移酶基因（aadAl/2/5)，比較之前的藥敏實驗結果，得到被測菌株對氨基糖苷類的鏈霉素、慶大霉素和磺胺類的復方新諾明都表現(xiàn)出較高的耐藥率，這與細菌基因組DNA和質粒DNA上的整合子可變區(qū)攜帶了這兩類藥物的耐藥基因表現(xiàn)出了高度的相關性，說明I類整合子攜帶的基因盒在介導大腸桿菌對氨基糖苷類和磺胺類藥物的耐藥性中發(fā)揮了重要