HBV感染患者肝移植術(shù)后PBMC內(nèi)HBV DNA存在狀態(tài)的研究.pdf

1、第一部分建立HBV cccDNA的PCR檢測體系目的:建立一種HBV cccDNA的PCR檢測體系.材料與方法:利用HBV cccDNA與rcDNA分子一級結(jié)構(gòu)之間的差異,設(shè)計(jì)兩對引物進(jìn)行巢式PCR反應(yīng),使cccDNA的擴(kuò)增效率顯著地高于rcDNA,從而通過其產(chǎn)生的差距,判斷待測標(biāo)本中是否存在cccDNA.此外,在巢式PCR首輪中,設(shè)計(jì)一對引物擴(kuò)增HBV S區(qū)基因保守區(qū)域,作為檢測體系的內(nèi)參照.以含HBV基因全序的PBHB4質(zhì)粒DNA作

2、為HBV cccDNA的標(biāo)準(zhǔn)品,以DANE顆粒抽提的HBV DNA作為HBV rcDNA的標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)過熒光定量檢測確定HBV DNA濃度.將上述標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系列稀釋后作為PCR檢測的模板,分別獲得檢測體系對HBV cccDNA和HBV rcDNA的檢測靈敏度,從而確定合適進(jìn)行HBV cccDNA檢測的HBV DNA模板濃度范圍.來源于臨床HBV感染患者的2份肝組織DNA標(biāo)本,2份血清DNA標(biāo)本(熒光定量PCR檢測值分別為1.5×10<'1

3、0>copies/ml和3.6×10<'7>copies/ml),作為檢測對象,驗(yàn)證檢測體系對臨床實(shí)際標(biāo)本的檢測效果.結(jié)論:HBV cccDNA的PCR檢測體系成功建立,可以臨床滿足對HBVcccDNA檢測的需要.第二部分HBV感染患者肝移植術(shù)后PBMC內(nèi)HBV DNA存在狀態(tài)的研究目的:通過檢測HBV感染患者肝移植術(shù)后PBMC內(nèi)HBV DNA和HBVcccDNA,探討PBMC內(nèi)HBV DNA存在狀態(tài)與HBV再感染的關(guān)系.材料與方法:隨

4、訪30例肝移植患者,其中男29例,女1例,年齡28~57歲,平均39.8歲.術(shù)后平均隨訪時(shí)間為19個月(6月~52月).術(shù)前均經(jīng)檢測證實(shí)血清HBsAg、抗HBc陽性;術(shù)前基礎(chǔ)疾病包括晚期肝炎肝硬化18例,原發(fā)性肝癌7例,重癥肝炎5例.均于術(shù)后開始持續(xù)服用拉米呋啶防治HBV再感染,部分患者聯(lián)用了HBIG.采集術(shù)后不同時(shí)期的外周血標(biāo)本,經(jīng)密度梯度離心法分離并洗滌PBMC.采用熒光定量PCR對PBMC細(xì)胞裂解液進(jìn)行HBV DNA檢測(檢測靈敏

5、度為0.5×10<'3>copies/ml),對部分HBV DNA檢測陽性標(biāo)本(HBV DNA定量>10<'6>copies/ml)進(jìn)行HBV cccDNA檢測.結(jié)論:盡管采取了積極預(yù)防HBV再感染的治療措施,HBV感染者肝移植術(shù)后1年、2年和3年的HBV再感染率分別達(dá)11.23﹪、34.85﹪和58.36﹪.PBMC內(nèi)普遍可以檢測到HBV DNA的存在,可能是HBV再感染的主要病毒來源.PBMC內(nèi)沒有檢測到HBV cccDNA,HBV