乙型肝炎感染者肝門淋巴結(jié)內(nèi)HBV DNA存在形式的實驗觀察.pdf

1、[目的]檢測乙型肝炎病毒感染者肝門淋巴結(jié)內(nèi)HBV DNA和HBVcccDNA及乙肝表面抗原，明確肝門淋巴結(jié)內(nèi)HBV的DNA分子在形式及乙肝表面抗原表達(dá)情況，探討肝門淋巴結(jié)內(nèi)HBV在肝移植術(shù)后乙肝復(fù)發(fā)過程中的作用。
　　[方法]實驗分為三部分。
　　第一部分：建立檢測肝門淋巴結(jié)內(nèi)HBV DNA和HBV cccDNA的檢測體系。根據(jù)入組病例的種族和地理分布特點(diǎn)，在GenBank選取HBV的B型、C型全基因序，對比序列差異，在S區(qū)

2、、C區(qū)、X區(qū)內(nèi)選擇相對保守的區(qū)域各設(shè)計一對巢式或半巢式引物，當(dāng)樣本在兩個或三個區(qū)域為陽性時，認(rèn)為該樣本HBV DNA為陽性；根據(jù)cccDNA的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特點(diǎn)，利用PSAD消化去除rcDNA和整合型HBV DNA的干擾后，利用跨越缺口的選擇性引物擴(kuò)增。以pCP10質(zhì)粒為陽性對照，對肝組織樣本DNA提取樣本進(jìn)行檢測，確定引物的最佳退火溫度和檢測靈敏度。
　　第二部分：慢性乙型肝炎相關(guān)肝移植受者肝門淋巴結(jié)的檢測。選取病例為2010年6

3、月至2011年3月因乙肝相關(guān)性終末期肝病于我院行肝移植手術(shù)患者共36例，其中男性32例，女性4例，年齡40-65歲，平均54.4±6.8歲，所有患者均為血清HBsAg陽性且HBV DNA定量檢測陰性(小于100IU/mL為的檢測下限)。利用第一部分創(chuàng)建的方法，檢測肝門淋巴結(jié)內(nèi)的HBV DNA及cccDNA。
　　第三部分：HBsAg陽性肝移植供者肝門淋巴結(jié)的檢測。2010年6月至2011年7月，摘取自HBsAg陽性供者的肝門淋巴結(jié)

4、樣本共9例。利用第一部分建立的方法檢測肝門淋巴結(jié)內(nèi)HBV DNA和cccDNA。利用免疫組化和酶聯(lián)免疫吸附法測定肝門淋巴結(jié)內(nèi)HBsAg的表達(dá)。
　　實驗結(jié)果采用t檢驗和Fisher確切概率法分析。
　　[結(jié)果]
　　第一部分：成功建立了檢測肝門淋巴結(jié)內(nèi)HBV DNA和cccDNA的PCR體系。
　　第二部分：36例慢性乙型肝炎肝移植受者中，30例HBV DNA陽性，陽性率為83.3％(30/36)，HBV DNA

5、的三個獨(dú)立檢測區(qū)域，S區(qū)、C區(qū)和X區(qū)陽性率分別為86.1％(31/36)、86.1％(31/36)、66.7％(24/36)。17例HBV cccDNA陽性，陽性率47.2％(17/36)。
　　對該組病例，根據(jù)術(shù)前是否應(yīng)用核苷類藥物，分為用藥組(22人)和未用藥組(14人)，其中用藥組分為用藥時>3個月(14人)和≤3個月(8人)兩個亞組。HBV DNA陽性率：用藥組(72.7％，16/22)與未用藥組(100％，14/14)差

6、異無顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.062)，用藥組中用藥時間>3個月(71.4％，10/14)與≤3個月(75％，6/8)組間差異無顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P=1.000)。HBV cccDNA陽性率：用藥組(22.7％，5/22)較未用藥組(85.7％，12/14)顯著降低(P=0.000)，用藥組中用藥時間>3個月組(7.1％，1/14)較≤3個月組(50％，4/8)顯著降低(P=0.039)。
　　第三部分：9例HBsAg陽性肝移植供

7、者中，7例HBV DNA陽性，陽性率為77.8％，HBV DNA三個獨(dú)立檢測區(qū)域，S區(qū)、C區(qū)和X區(qū)陽性率分別為77.8％(7/9)、77.8％(7/9)、66.7％(6/9)。5例HBV cccDNA陽性，陽性率55.6％。HBV DNA(P=0.651)及cccDNA(P=0.722)陽性率與第二部無顯著性差異。
　　免疫組化結(jié)果為可觀察到少量疑似陽性細(xì)胞，分布零散。乙肝表面抗原酶聯(lián)免疫：3個檢測呈陽性，陽性率33.3％(3/9

8、)，低于肝門淋巴結(jié)中 HBV DNA和HBV cccDNA的檢出率。
　　[結(jié)論]
　　1.成功建立了檢測肝門淋巴結(jié)內(nèi)HBV DNA和HBV cccDNA的PCR體系，雜帶產(chǎn)生較少，方法靈敏度高，可用于相關(guān)研究。
　　2.對HBV感染者，HBV可感染其肝門淋巴結(jié)，肝門淋巴結(jié)可能為HBV的肝外儲庫之一，并可能為肝移植術(shù)后乙型肝炎病毒復(fù)發(fā)的原因之一。
　　3.對血清中HBV DNA滴度低于臨床檢測限的慢性乙肝患者，核