反向雜交檢測HBV耐藥突變方法的建立及評(píng)估.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)一直以來就威脅著全人類的健康,核苷(酸)類似物作為抗HBV感染的主要藥物,在抑制病毒方面取得了不錯(cuò)的成果。但隨著用藥時(shí)間延長,HBV都會(huì)在不同程度上表現(xiàn)出耐藥,嚴(yán)重制約后續(xù)藥物的選擇及其療效,那么,早期監(jiān)測耐藥就顯得至關(guān)重要。目前,多數(shù)HBV耐藥突變檢測技術(shù)限于實(shí)驗(yàn)研究,只有直接測序法,熒光定量PCR和線性探針分析法三種檢測技術(shù)用于臨床耐藥分析。相對(duì)其他兩種技術(shù)而言,基于反向雜交

2、原理的線性探針分析法簡便,快速,可以實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)檢測,具有廣闊的應(yīng)用前景。拉米夫定,阿德福韋和恩替卡韋是最早應(yīng)用于臨床乙型肝炎治療的藥物,本研究就是利用反向雜交原理,建立一種同時(shí)檢測HBV對(duì)這三種藥物耐藥的方法。為了優(yōu)化反應(yīng)條件,本研究還構(gòu)建了HBV耐藥標(biāo)準(zhǔn)株。隨后,對(duì)已建立的反向雜交體系進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)和臨床評(píng)估。
　　 目的：構(gòu)建HBV耐藥標(biāo)準(zhǔn)株,利用野生和耐藥標(biāo)準(zhǔn)株建立一種特異、靈敏地檢測HBV對(duì)三種核苷(酸)類似物耐藥的方法

3、,并對(duì)確立的檢測體系進(jìn)行評(píng)估以便了解其可行性。
　　 方法：⑴以擴(kuò)增得到的267bp的突變片段(rt169T,rt173L,rt180M,rt181 T,rt184G,rt202I,rt204V,rt215S,rt236T,rt250V)為誘變引物,HBV野生標(biāo)準(zhǔn)株為模板,PCR獲得HBV全序列耐藥標(biāo)準(zhǔn)株。⑵利用HBV野生和耐藥標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)反向雜交體系進(jìn)行一系列優(yōu)化,并篩選三種藥物相關(guān)的十個(gè)耐藥位點(diǎn)的理想探針(I169T,V173L

4、/G,L180M,A181T/V,T184G,S202I/G M204V/I,Q215S,N236T,M250V/I/L)。⑶對(duì)建立的反向雜交體系進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)和臨床評(píng)估。應(yīng)用本方法分別檢測HBV野生和耐藥標(biāo)準(zhǔn)株,分析其檢測特異性；將PCR產(chǎn)物以一定比例稀釋,確定其對(duì)PCR產(chǎn)物量的檢測下限；以一定比例混合野生和耐藥標(biāo)準(zhǔn)株,分析本方法對(duì)野生或耐藥突變的檢測靈敏度。為進(jìn)一步了解其臨床可行性,應(yīng)用本方法對(duì)10份未接受核苷(酸)類似物治療和30

5、曾接受核苷(酸)類似物治療的乙型肝炎患者血清標(biāo)本進(jìn)行檢測,其結(jié)果與直接測序法分析結(jié)果進(jìn)行比較,分析其檢測準(zhǔn)確性以及對(duì)病毒載量的檢測下限。
　　 結(jié)果：①成功構(gòu)建了HBV耐藥標(biāo)準(zhǔn)株(rt169T,rt173L,rt180M,rt181 T,rt184G,rt202I,rt204V,rt215S,rt236T,rt250V),經(jīng)直接測序證實(shí),其堿基序列與目的序列一致。②初步確立反向雜交體系,并篩選到較為理想的檢測探針。應(yīng)用此方法可以

6、區(qū)分單堿基差異,從而檢出三種藥物十個(gè)位點(diǎn)相關(guān)的耐藥突變。③方法學(xué)評(píng)價(jià)和臨床評(píng)估的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)本方法可以靈敏,特異地檢出HBV耐藥突變。當(dāng)PCR產(chǎn)物的量達(dá)到10ng/μ1時(shí),本方法有效檢測雜交信號(hào)；當(dāng)HBV野生或耐藥突變株占到病毒群體的5％時(shí),可以被檢測。臨床標(biāo)本的檢測結(jié)果與直接測序法分析結(jié)果一致,且病毒載量在104拷貝/ml以上時(shí),可以有效檢測。
　　 結(jié)論：本研究通過誘變引物替換野生標(biāo)準(zhǔn)株上對(duì)應(yīng)序列,快速,準(zhǔn)確地構(gòu)建HBV耐藥