2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:
  乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)基因突變是導(dǎo)致病毒耐藥的基礎(chǔ),雖然測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于HBV耐藥突變檢測(cè),但其較低的靈敏度大大限制了其臨床應(yīng)用價(jià)值;反向雜交的靈敏度較高,約為5%,但其價(jià)格較貴,操作不夠簡(jiǎn)便,尤其在發(fā)展中國家無法全面推廣;一些新的技術(shù),如質(zhì)譜分析、超深度測(cè)序和高通量測(cè)序等技術(shù)逐漸得以應(yīng)用,但是這些技術(shù)存在價(jià)格昂貴、操作繁瑣、數(shù)據(jù)分析工作量大、存在堿基錯(cuò)配等缺點(diǎn),較適合于研究目

2、的,不太適合于臨床應(yīng)用。為了克服以上方法的缺點(diǎn),建立高靈敏度、簡(jiǎn)便、價(jià)廉和實(shí)用的HBV耐藥突變檢測(cè)方法,本研究建立了低變性溫度共擴(kuò)增PCR(coamplification at lower denaturation temperature polymerase chain reaction, COLD-PCR)法并聯(lián)合Sanger測(cè)序技術(shù),將其應(yīng)用于HBV已知和未知的耐藥突變檢測(cè)。
  方法:
  1.根據(jù)HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)(

3、reverse transcriptase,rt)的常見突變位點(diǎn),設(shè)計(jì)可同時(shí)擴(kuò)增野生株和突變株HBV rt180~rt215序列的引物,通過改變PCR條件(主要是變性溫度),確定產(chǎn)物關(guān)鍵變性溫度(critical denaturation temperature,Tc),以富集突變株。
  2.建立以Tc作為變性溫度的Fast COLD-PCR及Full COLD-PCR(比前者增加了雜交過程,可富集所有的突變類型)/Sanger

4、測(cè)序法,與常規(guī)PCR/Sanger測(cè)序法相比較,確定兩種方法檢測(cè)突變株的靈敏度、最低檢出限及特異性。
  3.采用上述方法分別檢測(cè)30例發(fā)生長(zhǎng)期服用抗病毒核苷(酸)類似物(nucleos(t)ide analogues,NAs),并且發(fā)生病毒學(xué)突破的慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)患者的HBV基因突變,比較其突變株類型及其檢出率。
  結(jié)果:
  1.常規(guī)PCR/Sanger測(cè)序?qū)λ蓄愋?/p>

5、突變株的檢出靈敏度均為10%(突變型:野生型比例為1:10,下同)。對(duì)于單一位點(diǎn)的突變類型,當(dāng)發(fā)生熔解溫度(melting temperature,Tm)下降的突變(如C:G→T:A等)時(shí),F(xiàn)ast COLD-PCR對(duì)突變株的檢出靈敏度達(dá)1%,F(xiàn)ull COLD-PCR則為2%;對(duì)Tm不變或升高的突變(如C:G→G:C或T:A→C:G等),僅有Full COLD-PCR可提高對(duì)突變株的靈敏度為2%。對(duì)于多位點(diǎn)突變類型,F(xiàn)ast COLD

6、-PCR與Full COLD-PCR法檢出突變的靈敏度可進(jìn)一步提高為0.5%和1%。
  2.Fast COLD-PCR/Sanger測(cè)序法對(duì)不同突變類型的檢測(cè)濃度有所不同,對(duì)突變株 DNA的最低檢出限可從5.0E+01IU/ml~1.0E+03IU/ml不等;Full COLD-PCR/Sanger測(cè)序法對(duì)單一突變類型的檢測(cè)濃度大致相同,突變DNA濃度約≥5.0E+02IU/ml時(shí)即可檢出,對(duì)混合突變類型時(shí)最低檢出限可提高至1.

7、0E+02IU/ml。
  3.30例CHB患者常規(guī)PCR/Sanger測(cè)序法均未檢出HBV基因突變;COLD-PCR/Sanger測(cè)序法共檢出混合突變21例,其中Fast COLD-PCR/Sanger測(cè)序法檢出17例突變(5例rtA181T+rtM204I,3例rtA181T,3例rtM204I,2例rtV191I,2例rtH197H,1例rtQ182Q+rtV191I,1例rtM204I+rtK212K),F(xiàn)ull COLD

8、-PCR/Sanger測(cè)序法檢出14例突變(4例rtM204I,2例rtV191I,1例rtA181T,1例rtH197H,2例rtS189S+rtM204I,1例rtA181T+rtM204I,1例rtA180T+ rtM204V,1例rtQ182Q+rtV191I,1例rtS213S)。
  結(jié)論:
  聯(lián)合Fast/Full COLD-PCR與Sanger測(cè)序技術(shù),能夠顯著提高大量野生型HBV DNA背景中的少量突變型

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