一種新的家蠶生殖障礙突變的鑒定與基因定位.pdf

1、家蠶(Bombyx mori)作為重要經(jīng)濟(jì)昆蟲和鱗翅目昆蟲模式,其突變體是生理學(xué)、遺傳學(xué)、功能基因組學(xué)等研究寶貴資源,現(xiàn)已保存有600余種穩(wěn)定的天然突變體,已有300多個突變性狀被定位到了230多個位點(diǎn)上。家蠶基因組精細(xì)圖的完成以及SSR、SNP分子標(biāo)記定位技術(shù)的日趨成熟,為重要突變性狀的圖位克隆奠定了基礎(chǔ),家蠶性別決定與生殖、發(fā)育變態(tài)、抗性、經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的功能基因的精細(xì)定位與克隆鑒定研究已成為近期的研究熱點(diǎn),并取得了矚目的進(jìn)展。

2、>　　但在家蠶性別發(fā)生與生殖發(fā)育領(lǐng)域研究取得的進(jìn)展緩慢,最重要的原因是家蠶有關(guān)性別發(fā)生與生殖發(fā)育方面的遺傳材料缺乏。
　　家蠶性別決定與生殖與果蠅、線蟲等模式生物的差異較大,家蠶生殖相關(guān)的突變也鮮見報道,因此家蠶性別決定與生殖的分子機(jī)制研究進(jìn)展緩慢。本課題以本團(tuán)隊首次發(fā)現(xiàn)的一種兩性均表現(xiàn)生殖障礙的自然突變品系為材料,綜合應(yīng)用解剖學(xué)、組織化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等研究方法,分析其性狀遺傳規(guī)律,生殖系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和組織變化特性,對突變基因

3、進(jìn)行了分子標(biāo)記連鎖和精細(xì)定位分析。研究內(nèi)容及主要結(jié)果如下:
　　一、家蠶生殖障礙突變的發(fā)現(xiàn)與遺傳分析
　　2007年春蠶期在保育的實(shí)用品種皓月(魯系)出現(xiàn)高比例的不產(chǎn)卵雌蛾,初步解剖發(fā)現(xiàn)所有不產(chǎn)卵雌蛾體內(nèi)均無成熟的蠶卵。采集同蛾區(qū)的3頭雄蛾與皓月(鎮(zhèn)系)品系進(jìn)行雜交至F2群體中出現(xiàn)不產(chǎn)卵雌蛾的分離。經(jīng)10代以上同蛾區(qū)交配建立了家蠶生殖障礙突變系。
　　經(jīng)過同一對親本所產(chǎn)生的45蛾區(qū)的F2群體的遺傳分析表明,突變性狀受1

4、個隱性基因控制,純合隱性個體表現(xiàn)為雌蛾無卵、雄蛾不能使交配雌蛾產(chǎn)出受精卵。該突變基因可以通過攜帶隱性突變基因的雜合子個體進(jìn)行遺傳傳遞。
　　二、家蠶生殖障礙突變的解剖學(xué)與組織化學(xué)分析
　　野生型品種家蠶卵巢管隨著幼蟲期發(fā)育而變長,同時伴隨著卵子及卵室的發(fā)生和發(fā)育,在突變品系的部分個體發(fā)現(xiàn)卵巢管內(nèi)沒有卵子發(fā)生以及卵室形成,其卵巢管的伸長受到明顯抑制。對野生型品系母蛾產(chǎn)卵后的卵管和突變型雌蛾的卵巢制作切片進(jìn)行觀察,野生型與突變型

5、品系的卵巢的細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)并未發(fā)現(xiàn)明顯差異,因此可初步推斷無生殖細(xì)胞突變型個體的雌蠶卵子發(fā)生、遷移或分化階段的異?？赡苁侵饕?。
　　雄蠶精巢及雄蛾雌雄內(nèi)部生系統(tǒng)未見明顯的形態(tài)差異。切片觀察表明在野生型品種的化蛹2d-3d的精巢中每個精巢小室內(nèi)充滿發(fā)育中的精子束,而在突變系的精巢中,精巢小室內(nèi)呈空腔狀,沒有發(fā)現(xiàn)精子束的存在。野生型品系雄蛾的貯精囊內(nèi)存在大量精子束,而突變體貯精囊內(nèi)未能發(fā)現(xiàn)精子束的存在?？梢哉J(rèn)為突變型雄蛾個體不能使

6、交配雌蛾正常產(chǎn)受精卵的原因是因為不能產(chǎn)生精子所致。
　　因此,將本實(shí)驗研究的家蠶生殖障礙突變命名為家蠶無生殖細(xì)胞突變(mutation of non-germ-cell, ngc)。
　　三、生殖障礙突變基因ngc的連鎖與定位分析
　　由生殖障礙突變品系皓月作為母本,野生型品種大造(p50)作為父本組配F1和F2,收集表現(xiàn)突變表型的雌蛾和雄蛾F2個體285頭作為連鎖分析和定位分析群體,利用377測序儀和高分辨率熔解分析

7、(HRM)技術(shù)進(jìn)行連鎖分析和精細(xì)定位。連鎖分析的結(jié)果表明,無生殖細(xì)胞突變性狀是由單個隱性基因控制,決定該突變性狀的ngc基因位于第17連鎖群上。
　　繪制出了家蠶 ngc基因的分子標(biāo)記連鎖圖,連鎖圖的遺傳距離為29.7cM, Z17149和Z17S標(biāo)記與ngc距離最近,均為0.4cM。,Z17149標(biāo)記和Z17S標(biāo)記分別對應(yīng)于家蠶基因組 nscaf2865:4957849_4958073(+ strand)和nscaf2865:5

8、096445_5096643(+strand),兩者間的物理距離為138kb。
　　四、定位區(qū)域的候選基因預(yù)測
　　精細(xì)定位確定的138kb區(qū)域內(nèi)有2個預(yù)測基因 BGIBMGA007134-TA和BGIBMGA007135-TA,編碼的蛋白分別與與果蠅(Drosophila melanogaster)的D-Axin及埃及伊蚊(Aedes aegypti)的體軸抑制蛋白(axis inhibition protein, axi

9、n)高度同源。這2個預(yù)測基因的CDS間只有1233bp的間隔,根據(jù)兩者序列設(shè)計引物進(jìn)行RT-PCR并對產(chǎn)物進(jìn)行序列測定分析證明,兩者實(shí)際上是同屬一個基因,編碼家蠶的Axin蛋白。
　　Axin在Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中途徑發(fā)揮多重功能,Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動、黏附及機(jī)體發(fā)育等過程中起著重要調(diào)節(jié)作用。上述結(jié)果暗示了家蠶無生殖細(xì)胞突變可能與家蠶Axin蛋白及Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。
　　本實(shí)驗首次嘗試?yán)肏RM分析技術(shù)