一種視網(wǎng)膜色素變性小鼠致病基因的鑒定.pdf

1、視網(wǎng)膜色素變性是導(dǎo)致視力喪失的主要疾病之一，在全世界的發(fā)病率約為1/4000-1/3500。我們實驗室發(fā)現(xiàn)并建立了一種患有視網(wǎng)膜色素變性疾病的近交系小鼠(rdf小鼠，現(xiàn)已繁殖到F18代)。該小鼠遺傳方式為常染色體隱性遺傳，視網(wǎng)膜電圖檢測表現(xiàn)為成年時a、b波消失，且具有發(fā)病早、進(jìn)展快的特點，是人類視網(wǎng)膜色素變性的一種良好的疾病動物模型。
　　本課題研究目的為對這種視網(wǎng)膜退行性變小鼠的致病基因進(jìn)行鑒定。
　　方法：
　　1

2、.選擇一些常見的視網(wǎng)膜色素變性致病基因為候選基因，通過檢測其在rdf小鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)水平進(jìn)行致病基因的篩選。
　　2.對于表達(dá)異常的基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，采用特異性引物對候選致病基因進(jìn)行基因組擴增、基因型分析，并對擴增序列進(jìn)行測定和分析。
　　3.分別建立患病小鼠與野生昆明小鼠、C57BL/6J小鼠的雜交品系，分析視網(wǎng)膜退行性變與突變基因的關(guān)系，檢測突變基因在雜交系中的遺傳特點。4．觀察突變基因在同類系小鼠中的遺傳特點及與視網(wǎng)

3、膜退行性變的關(guān)系。5.觀察突變基因在rdf小鼠中mRNA表達(dá)的水平以及表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析。
　　結(jié)果：
　　1.通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)比較候選基因在不同小鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)編碼磷酸二酯酶β亞單位的pde6b基因在成年rdf小鼠視網(wǎng)膜中沒有表達(dá)，在出生后7天的小鼠中表達(dá)水平相對于相同年齡的野生型小鼠顯著降低。
　　2.設(shè)計引物對篩選到的rdf小鼠候選致病基因進(jìn)行基因組擴增并分析得到的序列，發(fā)現(xiàn)rdf小鼠的pde

4、6b基因第一個內(nèi)含子區(qū)存在一個逆轉(zhuǎn)錄病毒樣的插入序列（LTR序列）。RT-PCR檢測到逆轉(zhuǎn)錄病毒env基因的表達(dá)，序列分析表明該序列位于小鼠第5號染色體pde6b基因的第一個內(nèi)含子上，與xmv逆轉(zhuǎn)錄病毒的env序列具有100％的同源性。通過基因特異性引物進(jìn)行PCR擴增基因組片段并進(jìn)行序列測定將該插入序列的插入位置確定為pde6b第一個內(nèi)含子1505bp處。
　　3.將rdf小鼠分別與野生型昆明小鼠和C57BL/6J小鼠雜交，然后將

5、其子一代進(jìn)行互交和將子一代與患病親代進(jìn)行回交以收集雜交二代和回交小鼠。得到F1代小鼠10只，F(xiàn)2代小鼠61只，N2代小鼠60只。所有小鼠都經(jīng)視覺電生理技術(shù)進(jìn)行檢測確定其表型?；蛐头治霭l(fā)現(xiàn)這種插入突變等位基因與視網(wǎng)膜退行性變共分離。對于基因型確定為雜合狀態(tài)的雜交二代小鼠進(jìn)行互交得到F3代小鼠53只，其表型與該插入突變等位基因也表現(xiàn)出共分離的特點。
　　4.將致病基因?qū)氲紺57BL/6J小鼠中，對其家系進(jìn)行表型鑒定和基因型分析，發(fā)

6、現(xiàn)候選致病基因在同類系小鼠中穩(wěn)定遺傳、與視網(wǎng)膜退行性變有直接關(guān)系。
　　5.克隆并測序了正常昆明小鼠以及rdf小鼠pde6b基因的編碼區(qū)全長，發(fā)現(xiàn)昆明小鼠pde6b基因的編碼區(qū)與GeneBank中參考序列(NM_008806)有兩個位點差異：昆明小鼠第706位堿基為A，而數(shù)據(jù)庫中序列為G；第1149位堿基前者為T，后者為C。rdf小鼠pde6b基因的編碼區(qū)序列與野生昆明小鼠類似。
　　結(jié)論：
　　該研究從遺傳學(xué)角度證實