視網(wǎng)膜色素變性大鼠Muller細胞逆分化為視網(wǎng)膜前體細胞的研究.pdf

1、視網(wǎng)膜色素變性(Retina pigmentosa)是一種嚴重的致盲眼病,以光感受器細胞死亡為主要病理特征,臨床上缺乏有效的治療方法。目前很多研究集中在視網(wǎng)膜干細胞移植領(lǐng)域,以期望移植的細胞能夠補充并修復(fù)視網(wǎng)膜色素變性過程中受損的視網(wǎng)膜光感受器細胞(Tomita et al.,2005)(MacLaren et al.,2006)(West et al.,2008)。雖然視網(wǎng)膜干細胞移植目前仍存在許多問題,如:移植細胞存活數(shù)量較少;移植

2、細胞向光感受器細胞分化比例較低;難以驗證移植細胞真正參與了宿主視網(wǎng)膜的視覺形成過程等,但是多數(shù)實驗證實視網(wǎng)膜干細胞移植能夠一定程度上改善視網(wǎng)膜色素變性動物模型的視功能(Seiler et al.,2008a)(Wang et al.,2008)Gamin(Gamm et al.)。因此,視網(wǎng)膜干細胞移植仍被認為是治療視網(wǎng)膜色素變性疾病最具有潛在應(yīng)用前景治療方法。
　　 視網(wǎng)膜前體細胞概念的提出讓人們從另一個角度認識視網(wǎng)膜損傷后自

3、我修復(fù)能力?，F(xiàn)在研究已證實,在成年哺乳動物視網(wǎng)膜內(nèi)多個部位存在視網(wǎng)膜前體細胞(Perronand Harris,2000)。如:視網(wǎng)膜睫狀上皮細胞(Ahmad et al.,2000)(Tropepe et al.,2000)虹膜色素上皮細胞(Haruta et al.,2001)(Asami et al.,2007)等。最近研究發(fā)現(xiàn),成年動物體內(nèi)的視網(wǎng)膜Miiller細胞也具有成為視網(wǎng)膜前體細胞的潛在能力(Fischer and Re

4、h,2001)(Ooto et al.,2004)(Osakada and Takahashi,2007)。本實驗室既往應(yīng)用免疫印跡方法研究發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜前體細胞標記物Chx10表達量在RCS(Roval College Surgery,RCS)大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)呈現(xiàn)出生后減低至消失,而成年又出現(xiàn)增加的趨勢。
　　 既往對Müller細胞的認識僅停留在對神經(jīng)膠質(zhì)細胞的傳統(tǒng)認識上。隨著人們對神經(jīng)膠質(zhì)細胞認識的深入,發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜Müller細

5、胞具有逆分化為視網(wǎng)膜前體細胞的潛能。在哺乳動物視網(wǎng)膜中Müller細胞在正常情況無法重新進入細胞周期開始逆分化,但是在一些急性損傷的情況下,如:應(yīng)用NMDA造成小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞和無長突細胞死亡(Karl et al.,2008)應(yīng)用MNU造成大鼠視網(wǎng)膜光感受器細胞死亡(Wan et al.,2008),或是應(yīng)用激光造成小鼠視網(wǎng)膜急性損傷(Kohno et al.,2006),視網(wǎng)膜Müller細胞均可重新進入細胞周期并逆分化為視網(wǎng)膜

6、前體細胞。同時有研究發(fā)現(xiàn),外源性給予視網(wǎng)膜Müller細胞營養(yǎng)因子,如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain Derived NeurotrophicFactor,BDNF)、膠質(zhì)源性生長因子(Glia Derived Neurotropic Factor,GDNF)可增強其逆分化能力(Nickerson et al.,2008)(Insua et al.,2008)。然而,這些研究都是停留在急性損傷中,尚未見慢性損傷導(dǎo)致Müller細胞逆分化

7、的報道。綜合上述各項研究,結(jié)合本實驗室既往研究結(jié)果,提出假設(shè):RCS大鼠視網(wǎng)膜變性作為一種慢性刺激可導(dǎo)致Müller細胞出現(xiàn)逆分化并開始表達視網(wǎng)膜前體細胞表面標志物。視網(wǎng)膜干細胞移植或聯(lián)合BDNF移植可增強RCS大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞逆分化能力,從而達到延緩視網(wǎng)膜色素變性的作用。
　　 針對以上假設(shè),本文的主要內(nèi)容及研究結(jié)果如下:
　　 1、應(yīng)用組織化學(xué)方法觀察RCS大鼠發(fā)育過程中視網(wǎng)膜形態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)RCS大鼠視網(wǎng)膜

8、形態(tài)改變開始于15天(睜眼時間),30d時達到高峰,90d及120d時屬于視網(wǎng)膜色素變性晚期;應(yīng)用免疫熒光化學(xué)技術(shù),研究在RCS大鼠視網(wǎng)膜慢性退行性變過程中,視網(wǎng)膜前體細胞分布特性及變化規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn),RCS大鼠出生后視網(wǎng)膜前體細胞數(shù)量迅速減少,至睜眼(15d)時幾乎消失;但在視網(wǎng)膜色素變性高峰期時,視網(wǎng)膜前體細胞又重新出現(xiàn),并可持續(xù)存在至變性晚期;進一步應(yīng)用視網(wǎng)膜Müller細胞標志物-Vimentin雙重標記,發(fā)現(xiàn)在RCS大鼠變性高

9、峰期重新出現(xiàn)的視網(wǎng)膜前體細胞來源于視網(wǎng)膜Müller細胞逆分化。結(jié)果提示,RCS大鼠視網(wǎng)膜色素變性作為慢性刺激,可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜Müller細胞發(fā)生逆分化。
　　 2、通過條件培養(yǎng)基及傳代培養(yǎng)方法得到的視網(wǎng)膜干細胞具有自我增殖,自我復(fù)制和多向分化潛能,能夠分化為各類視網(wǎng)膜神經(jīng)元。經(jīng)流式細胞儀檢測培養(yǎng)3代后的視網(wǎng)膜干細胞純度較高,可作為本研究中移植的種子細胞。將DiI紅色熒光標記的大鼠視網(wǎng)膜干細胞經(jīng)鞏膜外路法移植入30天齡的RCS大

10、鼠視網(wǎng)膜下腔。于60d、90d及120d時檢測移植細胞存活、遷徙、分化,以及RCS大鼠視功能改善情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),移植細胞在RCS大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)可以存活至120d,并有向視網(wǎng)膜內(nèi)層遷徙的趨勢;初期移植細胞存活數(shù)量較多,主要分布在視網(wǎng)膜外核層,后期移植細胞存活數(shù)量減少,較多分布在視網(wǎng)膜內(nèi)核層。視網(wǎng)膜干細胞聯(lián)合BDNF移植,有利于移植細胞在RCS大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)存活。應(yīng)用免疫熒光化學(xué)技術(shù),檢測移植細胞向各種視網(wǎng)膜神經(jīng)元分化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜干細胞

11、移植或聯(lián)合BDNF移植后,移植細胞在RCS大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)具有向多種視網(wǎng)膜細胞分化的能力;早期傾向于向光感受器細胞方向分化,晚期則有較多向神經(jīng)膠質(zhì)細胞方向分化;聯(lián)合應(yīng)用BDNF未見明顯促進移植細胞向光感受器細胞分化。應(yīng)用視網(wǎng)膜電圖(ERG)檢測RCS大鼠視功能改善情況,Rod-ERG b波及Max-ERGb波振幅及潛時進行統(tǒng)計比較發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜干細胞移植在術(shù)后1月及2月時可改善RCS大鼠視功能,具體表現(xiàn)為Rod-b波及Max-b波潛時的縮短及

12、振幅的增高。聯(lián)合應(yīng)用BDNF后,可在術(shù)后1月時增強視網(wǎng)膜干細胞移植對RCS大鼠視功能的改善作用。
　　 3、在視網(wǎng)膜干細胞移植術(shù)后,應(yīng)用免疫熒光雙標技術(shù),觀察RCS大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞逆分化情況及視網(wǎng)膜前體細胞分布特點。結(jié)果發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜干細胞移植引起RCS大鼠視網(wǎng)膜前體細胞數(shù)量增多,且這些增多的視網(wǎng)膜前體細胞多數(shù)來源于視網(wǎng)膜Müller細胞逆分化,即視網(wǎng)膜干細胞移植增強了RCS大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞逆分化,且部分逆分化

13、的Müller細胞出現(xiàn)去分化現(xiàn)象,表達視網(wǎng)膜光感受器細胞標志物-Recoverin:然而,PBS偽手術(shù)及單純注射BDNF不能增強RCS大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞逆分化。經(jīng)過定量計數(shù)分析比較發(fā)現(xiàn),BDNF聯(lián)合視網(wǎng)膜干細胞移植有更強的促進Müller細胞逆分化作用。
　　 綜上所述,本課題得出如下結(jié)論:
　　 1、慢性視網(wǎng)膜色素變性這種刺激因素可以引起RCS大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞發(fā)生逆分化,表達視網(wǎng)膜前體細胞標志物。2、