視網(wǎng)膜祖細胞移植治療視網(wǎng)膜變性性疾病的相關研究.pdf

1、本研究將通過三部分,來介紹人類視網(wǎng)膜祖細胞(human retinal progenitor cell, hRPC)移植入視網(wǎng)膜變性小鼠的相關研究。第一部分:人類視網(wǎng)膜祖細胞的體外培養(yǎng);第二部分:對于 rhodopsin-/-小鼠視網(wǎng)膜變性過程的動態(tài)連續(xù)觀察;第三部分: rhodopsin-/-小鼠視網(wǎng)膜下 hRPC移植后的視網(wǎng)膜形態(tài)和功能變化的動態(tài)觀察。
　　第一部分:人類視網(wǎng)膜祖細胞的低氧培養(yǎng)
　　目的:比較人類視網(wǎng)膜祖

2、細胞(hRPC)在常氧濃度培養(yǎng)(20％氧濃度)和低氧濃度培養(yǎng)(3％氧濃度)下各方面性狀的差異,如細胞的自我更新、增殖及細胞向視網(wǎng)膜細胞分化的能力等。初步研究相關的細胞因子及信號通路,了解相關現(xiàn)象發(fā)生的機制。
　　方法:從人類胎兒視網(wǎng)膜中分離得到視網(wǎng)膜祖細胞,進行體外培養(yǎng)。培養(yǎng)條件分為常氧培養(yǎng)(20％氧濃度)和低氧培養(yǎng)(3％氧濃度),觀察細胞在兩種培養(yǎng)條件下生物學特性的差異,并在特定時間點收集各組細胞進行相關細胞因子的蛋白表達水平檢

3、測(蛋白免疫印跡實驗、免疫細胞化學檢測)和基因 mRNA水平檢測(聚合酶鏈式反應),通過這些檢測的結果推斷各細胞因子(低氧誘導因子)在低氧培養(yǎng)中發(fā)揮的作用。
　　結果:hRPC在低氧培養(yǎng)(3％氧濃度)條件下細胞增殖曲線及MTT實驗均提示較好的細胞增殖水平,實時熒光定量 PCR和細胞免疫化學染色也分別從相關基因 mRNA水平及蛋白表達水平方面說明了細胞增殖水平的增強,如Ki67、Cyclin D1。而且低氧培養(yǎng)條件下的hRPC維持了

4、向視網(wǎng)膜細胞分化的能力,Klf4、c-Myc在基因和蛋白水平表達均高于常氧培養(yǎng)條件。低氧誘導因子1a(Hypoxia inducible factor-1a,HIF-1a)在低氧培養(yǎng)的細胞中表達高于常氧培養(yǎng),且表達水平隨時間而變化。
　　結論:本研究證明低氧濃度培養(yǎng)環(huán)境有利于人類視網(wǎng)膜祖細胞的體外擴增,并能夠維持細胞向視網(wǎng)膜細胞分化的能力。低氧誘導因子1a可能在其中發(fā)揮關鍵作用。低氧培養(yǎng)模式可以為視網(wǎng)膜變性性疾病的研究和今后可能的

5、細胞移植治療提供大量未分化狀態(tài)的人類視網(wǎng)膜祖細胞。
　　第二部分: Rhodopsin-/-鼠視網(wǎng)膜變性過程的在體動態(tài)觀察
　　目的:視網(wǎng)膜色素變性(RP)和老年性黃斑變性(AMD)是兩類主要的造成不可逆性失明的視網(wǎng)膜變性性疾病。嚙齒類動物模型是我們理解這類疾病的重要工具。之前的研究已經(jīng)表明視網(wǎng)膜紫質(zhì)是視網(wǎng)膜光傳導過程中必不可少的要素,同時也是視桿細胞外節(jié)重要的結構蛋白。Rhodopsin-/-鼠不表達視網(wǎng)膜紫質(zhì),不形成視桿

6、細胞外節(jié),在出生后短短的幾個月內(nèi)視桿細胞便會消失,繼之是視錐細胞功能和數(shù)量的喪失。本部分研究采用頻域光學相干斷層掃描(Spectral Domain Optical Coherence Tomography, SD-OCT)動態(tài)連續(xù)性觀察 rhodopsin-/-鼠視網(wǎng)膜形態(tài)方面的變化。
　　方法:選擇出生后第3、6、9和12周的rhodopsin-/-鼠(C57Bl6 rhodopsin基因敲除)和野生型 C57Bl6鼠用于本研

7、究。SD-OCT采用放射狀體積掃描模式(以視盤為中心,直徑1.3mm的掃描范圍)。每個體積掃描包含100個B掃描(每個B掃描包含1000個A掃描)。選取特定的掃描進行視網(wǎng)膜外核層(outer nuclear layer, ONL)厚度的測量。在相應的時間點進行視網(wǎng)膜組織學檢查,并將得到的數(shù)據(jù)和SD-OCT所獲得的數(shù)據(jù)進行比較。記錄暗適應和明適應條件下的視網(wǎng)膜電圖(Electroretinograms,ERG),對視網(wǎng)膜功能學變化和形態(tài)學

8、變化進行相關性分析。
　　結果:SD-OCT測量數(shù)據(jù)顯示 rhodopsin-/-鼠視網(wǎng)膜外核層厚度在其出生后第3周至第12周逐漸變薄。第3、6、9和12周的厚度值分別為40.6±1.61μm,27.9±1.65μm,14.5±0.7μm和6.0±0.78μm。在 rhodopsin-/-鼠視網(wǎng)膜無法觀察到視桿細胞外節(jié)。視網(wǎng)膜組織學檢測數(shù)據(jù)顯示出同 OCT檢測相同的趨勢。在第3周時, rhodopsin-/-鼠視網(wǎng)膜外核層有9-1

9、0層細胞核,而C57Bl6鼠有11-12層細胞核;到第12周時,rhodopsin-/-鼠外核層細胞核層數(shù)已經(jīng)減低到1-2層,而野生型小鼠細胞核層數(shù)穩(wěn)定在11-12層。Rhodopsin-/-鼠的明適應和暗適應條件下的ERG均不能見到明顯 a波,而b波波幅也隨年齡增長而降低,同形態(tài)學觀察到的結果一致。而野生型 C57Bl6鼠在各時間點形態(tài)學和功能學的測量值基本穩(wěn)定。
　　結論:通過 SD-OCT測量得到的數(shù)據(jù)確認了rhodopsi

10、n-/-鼠外核層厚度在其出生后逐漸變薄,而在野生型小鼠中則沒有發(fā)現(xiàn)變化。并且視網(wǎng)膜組織學檢測和ERG功能學的定量檢測都證實了OCT所得到的結果。因此,SD-OCT可以作為一種無創(chuàng)性的、有效并且可靠的研究工具,用于動態(tài)觀察視網(wǎng)膜變性性疾病動物模型的疾病變化過程。
　　第三部分:Rhodopsin-/-鼠視網(wǎng)膜下視網(wǎng)膜祖細胞的移植
　　目的:將體外培養(yǎng)擴增的人視網(wǎng)膜祖細胞通過手術方式注入藥物(環(huán)孢素)免疫抑制的rhodopsin

11、-/-鼠視網(wǎng)膜下,觀察細胞移植后的存活、移行、和受體視網(wǎng)膜結合及分化等情況,評估移植后視網(wǎng)膜變性小鼠的視網(wǎng)膜形態(tài)(組織學檢測和SD-OCT檢測)和功能(ERG)的相關變化。
　　方法:移植細胞為體外低氧濃度(3％)培養(yǎng)的hRPC(細胞代數(shù)為第7至第9代)。移植受體鼠rhodopsin-/-鼠經(jīng)過環(huán)孢素免疫抑制。通過手術方式,將 hRPC(對照組注入 PBS)注射入小鼠視網(wǎng)膜下。于術后第3天和第3周對術眼進行 OCT觀察,并于第3周

12、 OCT觀察結束后進行 ERG檢測,隨后處死小鼠進行視網(wǎng)膜組織學檢測。
　　結果:在移植之后的第3天和第3周分別進行 OCT觀察,均可在移植成功的小鼠視網(wǎng)膜下見到移植細胞存在,并能夠通過隨后的組織學檢查證實。對組織學切片進行相關免疫染色后可以觀察到 rhodopsin-/-鼠視網(wǎng)膜下存活的移植細胞,但是在移植后第3周也幾乎觀察不到 hRPC向受體鼠視網(wǎng)膜的移行和整合。在對移植細胞小鼠和對照小鼠(僅在視網(wǎng)膜下注入 PBS)的視網(wǎng)膜功

13、能學檢查(ERG)中未見明顯差異。
　　結論:通過環(huán)孢素對細胞移植受體鼠進行免疫抑制,可以提高移植細胞的存活率。移植后細胞并未向受體視網(wǎng)膜移行和整合,視網(wǎng)膜功能檢測未見改善。
　　研究總結：
　　一、主要研究結果
　　1.人類視網(wǎng)膜祖細胞在低氧濃度培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出較好的增殖趨勢,增殖相關因子 Ki67、Cyclin D1在基因和蛋白水平的表達也高于常氧培養(yǎng);而低氧條件下干細胞特性相關因子 c-Myc、Klf4也同

14、樣有較高的基因和蛋白表達水平。低氧誘導因子1a在低氧培養(yǎng)的細胞中有表達,而在常氧培養(yǎng)細胞中僅有低量表達。
　　2.SD-OCT測量數(shù)據(jù)顯示 rhodopsin-/-鼠視網(wǎng)膜外核層厚度在其出生后第3周至第12周逐漸變薄。視網(wǎng)膜組織學檢測也顯示出相同的趨勢。Rhodopsin-/-鼠的ERG不能見到明顯 a波,而b波波幅也隨年齡增長而降低,同形態(tài)學觀察到的結果一致。而野生型 C57Bl6鼠在各時間點形態(tài)學和功能學的測量值基本穩(wěn)定。

15、r>　　3.SD-OCT可在移植成功的小鼠視網(wǎng)膜下見到移植細胞存在,并能夠通過隨后的組織學檢查證實。組織學切片可以觀察到 rhodopsin-/-鼠視網(wǎng)膜下存活的移植細胞,但幾乎觀察不到細胞向受體鼠視網(wǎng)膜的移行和整合。在對移植細胞小鼠和對照小鼠(視網(wǎng)膜下注入 PBS)的視網(wǎng)膜功能學檢查(ERG)中未見明顯差異。
　　二、研究結論：
　　1.低氧濃度培養(yǎng)條件有利于人類視網(wǎng)膜祖細胞的體外擴增,并能夠維持細胞的分化能力。低氧培養(yǎng)條

16、件下,細胞所表現(xiàn)出來的性狀可能受到低氧誘導因子1a的調(diào)控。低氧濃度培養(yǎng)可作為人類視網(wǎng)膜祖細胞常規(guī)的培養(yǎng)方式。
　　2.通過 SD-OCT測量得到的數(shù)據(jù)確認了rhodopsin-/-鼠外核層厚度在其出生后逐漸變薄。并且視網(wǎng)膜組織學檢測和ERG功能學的定量檢測都證實了OCT所得到的結果。SD-OCT可以作為一種無創(chuàng)性的、有效并且可靠的研究工具,用于動態(tài)觀察視網(wǎng)膜變性性疾病動物模型的疾病變化過程。
　　3.通過環(huán)孢素對 rhodo