一種轉(zhuǎn)基因家蠶后部絲腺突變體表型與機制分析.pdf

1、家蠶最具特色和被人類廣泛利用的價值是高效生產(chǎn)絲蛋白質(zhì)纖維。絲腺是家蠶高度特化的專一合成和分泌絲蛋白的器官，是人類馴化和選擇家蠶的主要對象。提高絲腺的蛋白質(zhì)合成與分泌效率，改良絲腺合成的蛋白質(zhì)纖維成分是養(yǎng)蠶業(yè)世界矚目的重大課題。伴隨家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日趨成熟，有效利用絲腺超強的蛋白質(zhì)合成能力生產(chǎn)外源蛋白，成為生物反應(yīng)器研究領(lǐng)域熱門課題;家蠶作為中國特色的模式動物研究，在農(nóng)業(yè)昆蟲的模式應(yīng)用和生物醫(yī)學(xué)的無脊椎動物替代領(lǐng)域也備受業(yè)者關(guān)注。本研究主

2、要內(nèi)容包括：
　　⑴通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建了家蠶后部絲腺發(fā)育突變體TBH。設(shè)計了全長3057 bp的Fib-H相似編碼序列Hpl(Fib-H-like gene)，通過Piggybac轉(zhuǎn)座子將Hpl轉(zhuǎn)入到家蠶基因組，篩選獲得了后部絲腺(PSG)特異表達Hpl的突變體TBH(hpl/hpl)。經(jīng)mRNA及蛋白水平檢測，外源基因Hpl在PSG成功表達。TBH幼蟲期的前部絲腺(ASG)與中部絲腺(MSG)發(fā)育正常，而PSG長度顯著短于野生型

3、，PSG直徑變粗且透光性降低、折疊數(shù)減少、出現(xiàn)大量結(jié)節(jié)“念珠”狀卷曲，且細胞核排列由野生型的樹突分支狀變得雜亂無章。TBH成熟幼蟲吐絲量減少，化蛹過程中裸蛹及半化蛹個體比例顯著增高。
　?、平档蛢?nèi)源絲素基因的表達能夠提高外源重組蛋白在后部絲腺中的表達量。TBH個體中，內(nèi)源的Fib-L和P25基因的轉(zhuǎn)錄水平與蛋白質(zhì)合成及分泌水平?jīng)]有下降，而Fib-H的mRNA水平降低了71.1％;分泌的絲素蛋白中，F(xiàn)ib-H的比例從野生型的91.8

4、6％降至71.01％。外源重組基因Hpl的mRNA水平雖然分別只有Fib-H和Fib-L的0.73‰和0.74‰，而HPL蛋白占絲素蛋白和分泌蛋白總量的量高達18.85％和15.46％，非常高效地翻譯和分泌了外源大分子蛋白HPL。進一步對PSG細胞DEGs分析，檢測到891個DEGs。TBH的PSG細胞中，不僅與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工相關(guān)的239個基因表達出現(xiàn)顯著差異，應(yīng)激和細胞凋亡以及神經(jīng)反應(yīng)相關(guān)的37個基因也受到顯著影響。顯示TBH系統(tǒng)在F

5、ib-H轉(zhuǎn)錄被下調(diào)的同時，非常顯著地提高了外源重組蛋白的產(chǎn)量。該結(jié)果對其他重組蛋白在絲腺中的生產(chǎn)提供了重要的參考意義及優(yōu)化思路。
　?、呛蟛拷z腺發(fā)育異常影響其退化過程中的程序性細胞死亡進程及30K蛋白的正常表達。在幼蟲-蛹變態(tài)過程的絲腺退化期，通過對轉(zhuǎn)基因突變體TBH的絲腺HE染色和PCD相關(guān)檢測表明:TBH的絲腺在退化過程中顯著慢于野生型。PSD中30K蛋白水平檢測結(jié)果顯示，5齡幼蟲期TBH與野生型家蠶之間無明顯差異;但絲腺退化

6、過程中，野生型家蠶在絲蛋白質(zhì)合成減速后，提高了30K蛋白水平合成水平，TBH家蠶的絲腺中30K蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平和30K蛋白水平明顯低于野生型。推測阻遏Fib-H等絲蛋白正常表達，會導(dǎo)致（后部）絲腺發(fā)育畸形，并進一步改變了絲腺退化過程中的PCD與絲腺生理蛋白質(zhì)合成功能的轉(zhuǎn)變，影響30K等蛋白參與的生殖發(fā)育等一系列生理功能，如導(dǎo)致產(chǎn)卵量明顯下降。
　?、纫訲BH為材料初步建立高蛋白/氨基酸血癥模型。如同高血脂、高血糖對人類身體的影響

7、，高蛋白或氨基酸血癥對人體的生命健康同樣具有嚴重的威脅，但至今還未有高蛋白/氨基酸血癥動物疾病模型的報道。本文的轉(zhuǎn)基因突變體TBH個體在蛹期血淋巴中的蛋白質(zhì)及游離氨基酸濃度急劇上升，出現(xiàn)6d-7d的高循環(huán)血高蛋白/氨基酸環(huán)境，并誘導(dǎo)TBH家蠶個體死亡。這是一例窗口期長占生命周期10％以上的高蛋白/氨基酸血癥模型，提高對研究高蛋白/氨基酸血癥動物組織病變機制、開發(fā)相關(guān)治療藥物具有重要意義。而且該時期動物（家蠶）不進食與活動，是一個封閉的生