家蠶吡哆醛激酶基因定點(diǎn)突變及突變體功能研究.pdf

1、維生素B6(VB6)是一類吡啶化合物的總稱，游離型為吡哆醇(pyridoxine，PN)、吡哆醛(pyridoxal，PL)和吡哆胺(pyridoxamine，PM)，對(duì)應(yīng)的磷酸酯型為磷酸吡哆醇(pyridoxine-5-phosphate，PNP)、磷酸吡哆醛(pyridoxal-5-phosphate，PLP)和磷酸吡哆胺(pyridoxamine-5-phosphate，PMP)，其中PLP是VB6的主要輔酶形式，參與氨基酸代謝的

2、各種反應(yīng)。吡哆醛激酶(pyridoxal kinase，PL 激酶)是VB6 代謝途徑中的關(guān)鍵酶，在金屬陽(yáng)離子和ATP 存在下，催化PN、PL和PM分別形成PNP、PLP和PMP。PL 激酶與磷酸吡哆醇氧化酶、磷酸酶一起維持細(xì)胞內(nèi)PLP 濃度穩(wěn)定，在VB6 代謝中發(fā)揮重要作用。
　　 家蠶(Bombyx mori)是蠶絲生產(chǎn)的重要經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，VB6 對(duì)蠶體氨基酸代謝、脂肪酸代謝以及轉(zhuǎn)氨酶活力的影響較大。家蠶發(fā)育過(guò)程中，伴隨著蛋白質(zhì)

3、短期內(nèi)的大量降解和合成。當(dāng)家蠶絲腺快速合成絲蛋白時(shí)，需要供給大量的氨基酸。桑葉蛋白質(zhì)中富含谷氨酸和天冬氨酸，轉(zhuǎn)氨基作用在絲蛋白的合成過(guò)程中尤為顯著。
　　 PL 激酶是家蠶VB6 轉(zhuǎn)換代謝的關(guān)鍵酶，關(guān)系到絲蛋白合成的聯(lián)動(dòng)調(diào)解機(jī)制。
　　 近幾年，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)家蠶PL 激酶進(jìn)行cDNA克隆、原核表達(dá)并初步分析了酶學(xué)性質(zhì)。前期研究克隆出家蠶吡哆醛激酶cDNA，經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)幾個(gè)重要且保守的氨基酸殘基在此蛋白中被替換。為明確家蠶

4、PL 激酶分子若干特定位置上的氨基酸殘基在酶活性功能上的作用進(jìn)行本研究。采用重疊延伸法對(duì)家蠶PL 激酶Thr47，Asn121，Ile54，Arg88和Trp230 氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建表達(dá)載體pET-22b-PL 激酶并轉(zhuǎn)入Escherichia coli Rosetta中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)親和層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，通過(guò)酶活力檢測(cè)進(jìn)行功能鑒定。家蠶PL 激酶Thr47、Ile54和Arg88 氨基酸殘基突變后酶催化活力分別下降