家蠶“明”死卵突變體l-em基因的定位克隆及功能研究.pdf

1、家蠶是一種完全變態(tài)昆蟲,以卵滯育,可以說卵是家蠶生命周期中的第一個發(fā)育階段,蠶卵品質(zhì)的好壞直接影響到幼蟲、蛹和成蟲的發(fā)育。正常卵通常呈短橢圓形、側(cè)面扁平且有輕微凹陷。本課題研究對象“明”死卵突變體(lethaleggof“ming”,l-em)是在實用品種“蘇·菊×明·虎”母本品系“明”的生產(chǎn)和保存過程中發(fā)現(xiàn)的一種死卵突變體,在產(chǎn)卵后一小時左右出現(xiàn)三角形凹陷,表現(xiàn)失水死亡特征;遺傳分析發(fā)現(xiàn)該突變由一對隱性基因控制,純合致死,遵循偽母性遺

2、傳規(guī)律;掃描電鏡觀察突變體卵殼,發(fā)現(xiàn)卵殼表面凹陷處小室的邊緣有明顯的裂紋,卵殼縱斷面中間層亦出現(xiàn)不連續(xù)的裂縫。本研究在對l-em卵突變體遺傳分析及表型觀察的基礎(chǔ)上,采用圖位克隆技術(shù)對l-em基因進(jìn)行了定位克隆,采用qRT-PCR、2-DE、RNAi等技術(shù)對候選基因進(jìn)行表達(dá)分析和功能驗證。主要研究結(jié)果如下:
　　一、l-em基因的定位
　　選擇l-em卵突變體隱性純合的雄性親本(P1)與p50近交系的雌性親本(P2)雜交,組配

3、F1代群體;F1代雌性個體與雄性親本(P1)回交,同時進(jìn)行蛾區(qū)內(nèi)自交分別組配BC1F群體及F2代群體。使用P1、P2和F1篩選了28個連鎖群上具有多態(tài)性的SSR分子標(biāo)記,并使用BC1F群體確定了l-em基因位于家蠶第十連鎖群;進(jìn)一步對2287個F2代群體中產(chǎn)死卵的雌性個體檢測,使用13個與l-em基因連鎖的具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記,將l-em基因定位于S65與S82兩個標(biāo)記之間,相距約360kb,繪制出l-em基因的分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜;

4、通過與家蠶基因組比對查明該區(qū)域內(nèi)包含24個基因。
　　二、候選基因的表達(dá)模式、基因結(jié)構(gòu)分析和功能驗證
　　通過對24個基因在正常蛾及l(fā)-em卵突變體蛾卵巢內(nèi)的表達(dá)分析,明確了2個差異表達(dá)基因BmVMP23和BmEP80為候選基因。BmVMP23基因的表達(dá)量在l-em卵突變體的卵巢中出現(xiàn)明顯下調(diào),而在l-em卵突變體的卵巢中則未檢測到BmEP80基因的表達(dá)。
　　反向PCR分析測序顯示BmVMP23基因終止密碼子后的第2

5、2個堿基至BmEP80基因ORF的第161個堿基間發(fā)生了突變,導(dǎo)致BmVMP23基因的3′-UTR和BmEP80基因結(jié)構(gòu)的不完整性。
　　對2個候選基因的RNAi試驗表明,經(jīng)BmEP80基因干擾后的部分雌蛾所產(chǎn)卵發(fā)生明顯的凹陷,且表型與l-em卵突變體所產(chǎn)卵的表型相似,而對BmVMP23基因干擾未見此現(xiàn)象。因而推斷BmEP80基因的突變是導(dǎo)致l-em卵突變體產(chǎn)生的主要原因。
　　三、l-em突變體卵巢組織差異蛋白質(zhì)分析

6、>　　通過雙向電泳技術(shù)對正常個體及l(fā)-em卵突變體的卵巢組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,結(jié)果顯示BmEP80基因所編碼的BmEP80蛋白從蛹期第九天開始在正常個體卵巢中大量表達(dá),而在l-em卵突變體的卵巢中則未檢測到該蛋白的表達(dá)。除了BmEP80蛋白之外的其他蛋白在正常個體和l-em卵突變體之間無明顯差異。進(jìn)一步說明了BmEP80蛋白的缺失是l-em卵突變體產(chǎn)生的主要原因。
　　四、候選基因BmVMP23的表達(dá)調(diào)控分析
　　鑒于l-

7、em卵突變體的BmVMP23基因的3′-UTR結(jié)構(gòu)被破壞,而3′-UTR為miRNAs的調(diào)控位點,為了分析miRNA對BmVMP23基因的表達(dá)調(diào)控作用,將BmVMP23基因的3′-UTR序列與家蠶的miRNAs序列比對,發(fā)現(xiàn)了一個與BmVMP23基因的3′-UTR序列匹配度極高的miRNA(bmo-miR-1a-3p)。熒光實時定量檢測該miRNA在正常個體卵巢中表達(dá)量較高,且其表達(dá)趨勢與BmVMP23基因的表達(dá)趨勢相反,而在l-em卵