水稻雄配子不育突變體的遺傳分析及功能基因克隆.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是植物分子生物學(xué)研究的良好單子葉植物模式生物。近年來(lái)，轉(zhuǎn)基因水稻被廣泛的研究應(yīng)用。然而，由于轉(zhuǎn)基因的遺傳及表達(dá)的不穩(wěn)定性和不可預(yù)知性，轉(zhuǎn)基因引起的水稻雌雄配子體發(fā)育問(wèn)題使許多轉(zhuǎn)基因水稻株系在育種上無(wú)法利用。因此，開展水稻花粉發(fā)育突變體篩選、相關(guān)功能基因克隆及研究不僅對(duì)水稻花粉發(fā)育及相關(guān)的基礎(chǔ)生物學(xué)研究具有重要的理論意義，而且對(duì)雜交稻及水稻轉(zhuǎn)基因育種具有重要的實(shí)際意義。 本文通過(guò)對(duì)多216個(gè)候選

2、株系進(jìn)行外源標(biāo)記基因的遺傳分析，結(jié)合花粉細(xì)胞學(xué)觀察和外源基因表達(dá)定量分析，建立了具有38個(gè)株系的水稻T-DNA插入雄配子不育突變體群體：借助TAIL-PCR技術(shù)，已獲得22個(gè)雄配子體突變體中轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的分子特征信息。選取了2個(gè)候選基因進(jìn)行了基因克隆和相關(guān)表達(dá)載體的構(gòu)建，獲得了相應(yīng)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株。獲得的主要研究結(jié)論有： 1、對(duì)篩選到216個(gè)自交后代外源標(biāo)記基因能夠穩(wěn)定保持1:1分離的轉(zhuǎn)基因水稻株系采用測(cè)交和/或雜

3、交方法檢測(cè)外源標(biāo)記基因(hpt基因)的遺傳規(guī)律，初步確定其中57個(gè)株系為雄配子不育候選突變體，39個(gè)株系為雌配子不育候選突變體。對(duì)上述雄配子不育候選突變體，通過(guò)多代測(cè)交和/或雜交方法進(jìn)行外源標(biāo)記基因的遺傳分析，結(jié)合花粉細(xì)胞學(xué)觀察和外源基因表達(dá)定量分析，建立了一個(gè)包含38個(gè)突變體的水稻T-DNA插入雄配子不育突變體群體。 2、利用TAIL-PCR獲得了22個(gè)水稻雄配子不育T-DNA插入突變體的側(cè)翼序列，依據(jù)BLAST結(jié)果及注釋信息

4、，發(fā)現(xiàn)有15個(gè)不同的插入位點(diǎn)，存在多個(gè)突變體插入相同位點(diǎn)或區(qū)域的現(xiàn)象，暗示了可能存在插入熱點(diǎn)。12個(gè)插入位點(diǎn)位于基因區(qū)或基因調(diào)控區(qū)，獲得了數(shù)個(gè)候選基因。 3、利用我們先前獲得到序列信息，選擇了其中2個(gè)候選基因(1個(gè)WRKY鋅指轉(zhuǎn)錄因子和1個(gè)未知保守蛋白)的啟動(dòng)子序列和其中未知保守蛋白基因序列，以pCAMBIA1300為骨架分別構(gòu)建了這兩個(gè)候選基因上游啟動(dòng)子區(qū)與GUS基因融合的表達(dá)載體p1300JM1P和p1300JM6P?；谖?/p>