水稻斑點(diǎn)葉突變體HM47的基因克隆與功能分析.pdf

1、斑點(diǎn)葉突變體是研究植物程序性細(xì)胞死亡和抗病性機(jī)制的重要材料。本研究以甲基磺酸乙酯(EMS)誘變優(yōu)良國際稻IR64得到的一個(gè)褐色斑點(diǎn)葉突變體HM47為材料，對(duì)該突變體的表型特征、生理生化特征、抗病性及防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析，并對(duì)控制該突變體斑點(diǎn)葉性狀的基因進(jìn)行定位、克隆和功能分析，取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1、HM47的表型:在大田條件下，斑點(diǎn)葉突變體HM47的褐色斑點(diǎn)表型從播種十天后開始出現(xiàn)在第一片葉子的葉尖部位，其后

2、隨著水稻的生長發(fā)育而逐漸增多直至遍布整張葉片，新生的葉片也出現(xiàn)同樣的褐色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)性狀伴隨整個(gè)生育期。農(nóng)藝性狀考察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型IR64相比，HM47在株高、有效分蘗數(shù)、穗長、每穗實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重上均存在極顯著的降低。
　　2、HM47的理化特征:突變體斑點(diǎn)的產(chǎn)生受光照的誘導(dǎo)。與野生型IR64相比，突變體的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均存在極顯著降低。光合指標(biāo)相關(guān)的參數(shù)在突變體和野生型中也存在差異。突變體HM47斑

3、點(diǎn)處和斑點(diǎn)周圍存在細(xì)胞死亡并伴隨過氧化氫的沉積。突變體HM47葉片清除活性氧的酶系統(tǒng)中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸氧化酶(APX)的活性顯著高于野生型，過氧化氫酶(CAT)的活性則顯著低于野生型。此外，突變體中丙二醛(MDA)的含量均極顯著高于野生型，而可溶性蛋白含量極顯著低于野生型。
　　3、HM47的抗性變化:與野生型相比，突變體對(duì)白葉枯病菌小種的抗性普遍增強(qiáng)，對(duì)稻瘟病小種的抗性也有所提高。突變體的

4、白葉枯病抗性與斑點(diǎn)葉性狀高度相關(guān)。防衛(wèi)反應(yīng)基因POC1、PBZ1、PAL、POX22.3在突變體中的表達(dá)水平顯著高于野生型，而PR1在兩者中的表達(dá)并無差異。結(jié)果說明，HM47是一個(gè)白葉枯病廣譜抗性突變體，其抗性的增強(qiáng)是通過提高防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)的。
　　4、褐色斑點(diǎn)葉表型受一對(duì)隱性核基因控制:以HM47為母本，IR24和Moroberekan為父本進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)F1呈現(xiàn)正常葉色表型，說明斑點(diǎn)葉突變體HM47由隱性基因控制

5、。在HM47/IR24、HM47/Moroberekan的F2群體中，卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常葉色單株與斑點(diǎn)表型單株的分離比符合3∶1(x2＜x20.05=3.84)，且來自HM47/IR24的7個(gè)F3株系分離比也符合3∶1(x2＜x20.05=3.84)，說明該斑點(diǎn)葉突變體HM47的斑點(diǎn)表型是由單隱性基因核控制，命名為splHM47。
　　5、單堿基突變導(dǎo)致斑點(diǎn)表型的產(chǎn)生:利用圖位克隆法將該基因定位于第4染色體長臂約20kb區(qū)間內(nèi)，該區(qū)

6、間包含3個(gè)開放閱讀框，測序發(fā)現(xiàn)第1個(gè)ORF和第3個(gè)ORF在基因組上沒有差異，而第2個(gè)開放閱讀框LOC_Os04h56480(pelota，putative，expressed)的編碼區(qū)的第556位堿基由T突變成A(T556A)。該位點(diǎn)的突變導(dǎo)致一個(gè)氨基酸的替換，由野生型中的苯丙氨酸突變?yōu)楫惲涟彼帷９δ芑パa(bǔ)證實(shí)splHM47就是控制斑點(diǎn)表型產(chǎn)生的基因;RNAi干涉粳稻品種日本晴得到的轉(zhuǎn)基因植株表型正常，但splHM47的表達(dá)已被下調(diào);sp