水稻斑點葉突變體HM47的基因克隆與功能分析.pdf

1、斑點葉突變體是研究植物程序性細胞死亡和抗病性機制的重要材料。本研究以甲基磺酸乙酯(EMS)誘變優(yōu)良國際稻IR64得到的一個褐色斑點葉突變體HM47為材料，對該突變體的表型特征、生理生化特征、抗病性及防衛(wèi)反應相關基因的表達進行分析，并對控制該突變體斑點葉性狀的基因進行定位、克隆和功能分析，取得的主要研究結果如下:
　　1、HM47的表型:在大田條件下，斑點葉突變體HM47的褐色斑點表型從播種十天后開始出現(xiàn)在第一片葉子的葉尖部位，其后

2、隨著水稻的生長發(fā)育而逐漸增多直至遍布整張葉片，新生的葉片也出現(xiàn)同樣的褐色斑點，斑點性狀伴隨整個生育期。農(nóng)藝性狀考察結果發(fā)現(xiàn)，與野生型IR64相比，HM47在株高、有效分蘗數(shù)、穗長、每穗實粒數(shù)、結實率和千粒重上均存在極顯著的降低。
　　2、HM47的理化特征:突變體斑點的產(chǎn)生受光照的誘導。與野生型IR64相比，突變體的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均存在極顯著降低。光合指標相關的參數(shù)在突變體和野生型中也存在差異。突變體HM47斑

3、點處和斑點周圍存在細胞死亡并伴隨過氧化氫的沉積。突變體HM47葉片清除活性氧的酶系統(tǒng)中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸氧化酶(APX)的活性顯著高于野生型，過氧化氫酶(CAT)的活性則顯著低于野生型。此外，突變體中丙二醛(MDA)的含量均極顯著高于野生型，而可溶性蛋白含量極顯著低于野生型。
　　3、HM47的抗性變化:與野生型相比，突變體對白葉枯病菌小種的抗性普遍增強，對稻瘟病小種的抗性也有所提高。突變體的

4、白葉枯病抗性與斑點葉性狀高度相關。防衛(wèi)反應基因POC1、PBZ1、PAL、POX22.3在突變體中的表達水平顯著高于野生型，而PR1在兩者中的表達并無差異。結果說明，HM47是一個白葉枯病廣譜抗性突變體，其抗性的增強是通過提高防衛(wèi)反應基因的表達水平來實現(xiàn)的。
　　4、褐色斑點葉表型受一對隱性核基因控制:以HM47為母本，IR24和Moroberekan為父本進行雜交，發(fā)現(xiàn)F1呈現(xiàn)正常葉色表型，說明斑點葉突變體HM47由隱性基因控制

5、。在HM47/IR24、HM47/Moroberekan的F2群體中，卡方檢驗發(fā)現(xiàn)正常葉色單株與斑點表型單株的分離比符合3∶1(x2＜x20.05=3.84)，且來自HM47/IR24的7個F3株系分離比也符合3∶1(x2＜x20.05=3.84)，說明該斑點葉突變體HM47的斑點表型是由單隱性基因核控制，命名為splHM47。
　　5、單堿基突變導致斑點表型的產(chǎn)生:利用圖位克隆法將該基因定位于第4染色體長臂約20kb區(qū)間內(nèi)，該區(qū)

6、間包含3個開放閱讀框，測序發(fā)現(xiàn)第1個ORF和第3個ORF在基因組上沒有差異，而第2個開放閱讀框LOC_Os04h56480(pelota，putative，expressed)的編碼區(qū)的第556位堿基由T突變成A(T556A)。該位點的突變導致一個氨基酸的替換，由野生型中的苯丙氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?。功能互補證實splHM47就是控制斑點表型產(chǎn)生的基因;RNAi干涉粳稻品種日本晴得到的轉基因植株表型正常，但splHM47的表達已被下調(diào);sp