兩類水稻窄葉突變體的基因克隆與功能研究.pdf

1、水稻是重要的糧食作物之一。葉片是進(jìn)行光合作用的主要器官，對植物的生長發(fā)育具有重要的作用。葉片形態(tài)的改變直接影響水稻光合速率，蒸騰速率和水稻產(chǎn)量。目前，有關(guān)窄葉基因的報(bào)道并不多，克隆出相關(guān)的基因則是更少，挖掘出更多與葉片寬度有關(guān)的基因?qū)?huì)為進(jìn)一步研究水稻葉片寬度發(fā)育的分子機(jī)理打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究對兩個(gè)水稻葉型突變體進(jìn)行了形態(tài)及細(xì)胞學(xué)觀察、基因圖位克隆以及功能分析，分為以下兩個(gè)部分：
　　1、利用EMS誘變粳稻品種圣稻808，得到穩(wěn)

2、定隱性遺傳窄葉突變體sd110。對突變體sd110的研究結(jié)果如下：
　　（1）突變體 sd110主要性狀表現(xiàn)為葉片寬度減少了50％（劍葉表型較輕，倒二、倒三葉更為嚴(yán)重）、葉長變短，植株半矮，莖節(jié)數(shù)目減少、長度變短，分蘗增多。
　?。?）通過對sd110葉片橫向徒手切片，發(fā)現(xiàn)突變體葉片大脈、小脈數(shù)量減少。在顯微鏡下觀察和統(tǒng)計(jì)葉片下表皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞大小變化不明顯，而細(xì)胞數(shù)目顯著減少。
　?。?）遺傳分析表明，該葉形突變體

3、受1對隱性基因控制。運(yùn)用圖位克隆技術(shù)將突變位點(diǎn)鎖定在第3號染色體59 kb區(qū)域內(nèi)。對該區(qū)間內(nèi)所有基因進(jìn)行測序后，發(fā)現(xiàn)LOC_Os03g10340（編碼核糖體蛋白小亞基）第二內(nèi)含子5’端拼接點(diǎn)處由GT突變?yōu)锳T。cDNA測序結(jié)果顯示，突變體中該基因發(fā)生了兩種錯(cuò)誤的拼接方式。第一種：第二內(nèi)含子未被剪切掉；第二種：在原有的內(nèi)含子5’端拼接處前8個(gè)堿基又識別了一個(gè)新的拼接點(diǎn)。將該基因的野生型基因組DNA片段轉(zhuǎn)入到sd110突變體中可以回補(bǔ)突變表

4、型；將該基因的RNAi干擾載體轉(zhuǎn)入到野生型中能夠產(chǎn)生與sd110突變體相似的表型,從而證實(shí)了該基因就是控制葉片寬度的目的基因。.
　?。?）實(shí)時(shí)定量 PCR和 GUS組織化學(xué)染色結(jié)果顯示該基因在葉片、種子、莖節(jié)、幼穗中的表達(dá)量比較高。
　?。?）構(gòu)建該基因編碼序列與綠色熒光蛋白基因GFP的瞬時(shí)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。
　　2、利用60Co-γ射線誘變粳稻品種春江06，得到穩(wěn)定隱性遺傳窄葉突

5、變體F2-195。對突變體F2-195的研究結(jié)果如下：
　?。?）突變體F2-195主要性狀表現(xiàn)為葉片變細(xì)、穎殼開裂以及分蘗增多，但植株高度和葉片長度變化較小。在體視顯微鏡下觀察突變體 F2-195葉片橫截面，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，突變體葉片大脈、小葉脈數(shù)量分別減少了50%。通過刮除 F2-195葉片上表皮，統(tǒng)計(jì)葉片下表皮的細(xì)胞大小和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)葉片寬度的變化主要是由于細(xì)胞數(shù)目減少50%，而細(xì)胞寬度沒有明顯變化。石蠟切片結(jié)果顯示突變體F

6、2-195葉片邊緣發(fā)育不正常。
　　（2）利用圖位克隆的方法，將突變體F2-195的突變位點(diǎn)定位于第11和12號染色體短臂上12.7 kb區(qū)域內(nèi)，目標(biāo)區(qū)間內(nèi)只有一個(gè)基因即WOX3。經(jīng)水稻基因組網(wǎng)站分析得知，水稻第11和12染色體短臂（0-3 Mb）發(fā)生了大片段復(fù)制。測序結(jié)果表明，第11染色體上的 WOX3（LOC_Os11g01130，命名為NAL2）在野生型和突變體F2-195中均發(fā)生了自然突變，在+477 bp處插入了一個(gè)長度

7、為5211 bp反轉(zhuǎn)座子；而第12染色體上的WOX3（LOC_Os12g01120，命名為NAL3）在突變體F2-195中發(fā)生了大片段缺失，從而導(dǎo)致NAL2/3功能缺失，最終產(chǎn)生細(xì)葉表型。
　?。?）將WOX3啟動(dòng)子序列（2500 bp）與報(bào)告基因GUS融合，并轉(zhuǎn)化水稻品種Shiokari。GUS染色結(jié)果表明，該基因在幼葉、葉鞘、莖節(jié)、葉枕、幼穗等分裂旺盛的組織中表達(dá)量比較高。
　?。?）WOX3屬于Wuschel rela

8、ted homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族。為了證實(shí)WOX3是否具有轉(zhuǎn)錄激活或抑制活性，將WOX3編碼序列及WUS Box點(diǎn)突變后的WOX3(WOX3M)編碼序列分別與酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合，用來驅(qū)動(dòng)上游含GAL4結(jié)合序列的熒光素酶基因在水稻原生質(zhì)體中表達(dá)。通過檢測熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn) WOX3具有明顯的轉(zhuǎn)錄抑制活性。為了進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)論，分別構(gòu)建WOX3M與轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64和抑制基序EAR融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化F2-1

9、95突變體，發(fā)現(xiàn)WOX3M-EAR轉(zhuǎn)基因后代葉型變寬，而WOX3M-VP64葉型變窄，最終證實(shí)WOX3具有轉(zhuǎn)錄抑制作用。
　?。?）動(dòng)態(tài)分析野生型和突變體第一片葉片細(xì)胞分裂情況，連續(xù)統(tǒng)計(jì)11天，發(fā)現(xiàn)突變體細(xì)胞分裂速率明顯慢于野生型，從而推測突變體窄葉表型是由于細(xì)胞分裂速率降低造成的。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，突變體S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)目減少，G1期數(shù)目增加。定量PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體中一些抑制細(xì)胞分裂G1/S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵基因如

10、KRP1、 KRP3、 KRP4和RB1的表達(dá)量上調(diào)。
　?。?）構(gòu)建了F2-195(nal2/3)與另一已知窄葉突變體nal1的三突變體，發(fā)現(xiàn)三突變體整體形態(tài)和葉片表型均偏向于nal1，證明在葉型調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中nal2/3可能位于nal1的上游。
　?。?）構(gòu)建了F2-195(nal2/3)與已得到的窄葉突變體sd110的三突變體，發(fā)現(xiàn)三突變體整體形態(tài)和葉片表型均偏向于nal2/3，證明在葉型調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中nal2/3可能位于sd