三個(gè)水稻葉色突變體的鑒定與基因克隆.pdf

1、突變體是功能基因組學(xué)研究的重要材料。以粳稻品種(OryzasativaL.subsp.japonica)日本晴為受體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，我們實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了由20000多個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系組成的T-DNA插入突變體庫。從該突變體庫T1代群體中尋找性狀可見突變體，發(fā)現(xiàn)了三個(gè)葉綠素缺陷突變體：低溫敏感的葉色突變體ltc、缺葉綠素b突變體cbl和高溫敏感葉色突變體cde(t)。本論文針對這三個(gè)突變體，開展了性狀鑒定、遺傳分析、基因克隆和

2、初步的功能驗(yàn)證的研究。主要結(jié)果如下： 1.ltc突變體是低溫敏感的葉綠素缺陷突變體，在限制性溫度(23℃或更低溫度)下，突變體葉片出現(xiàn)大面積白化的現(xiàn)象，色素含量測定顯示，突變體葉綠素和類胡蘿卜素含量明顯低于野生型植株，然而生長在高溫條件(32℃)下，該突變體和野生型植株葉綠素含量差別不大；遺傳分析表明該突變是單基因控制的隱性突變。 2.PCR和潮霉素抗性分析顯示突變體ltc突變性狀和T-DNA插入共分離；通過TAIL-P

3、CR獲得了插入位點(diǎn)的旁鄰序列，序列分析顯示T-DNA插入到一個(gè)H+-ATPase基因的第一個(gè)外顯子上。構(gòu)建了ltc基因的干涉載體，遺傳轉(zhuǎn)化后獲得了葉綠素缺陷表型的T0代轉(zhuǎn)基因植株，這些植株和相同溫度下的ltc突變體表型相似。 3.cbl突變體是完全缺乏葉綠素b突變體，突變體具有葉黃，半矮化和分蘗少的特點(diǎn)；遺傳分析顯示該突變性狀是由一對隱性核基因控制的；突變體和T-DNA的共分離分析表明葉色突變不是T-DNA插入引起的。

4、4.構(gòu)建了cbl基因的定位群體，通過大量cbl位點(diǎn)附近分子標(biāo)記的獲得，構(gòu)建了cbl位點(diǎn)的高密度物理圖譜，最后將cbl基因定位于第10染色體分子標(biāo)記IDJ9和RM496之間23kb的區(qū)段；序列分析顯示葉綠素a氧化酶基因是cbl基因的候選基因，構(gòu)建了葉綠素a氧化酶基因的干涉載體，遺傳轉(zhuǎn)化后獲得了葉色黃綠的T0代轉(zhuǎn)基因植株。 5.cdel(t)突變體是高溫敏感的葉綠素缺陷突變體，該突變體在非限制性溫度下(23℃或更低的溫度)表型正常，

5、然而在限制性溫度下(26℃或更高的溫度)呈現(xiàn)不正常的黃綠葉表型；遺傳分析顯示該突變性狀是由一對隱性核基因控制的；突變體和T-DNA的共分離分析表明該突變不是T-DNA插入引起的。 6.為了克隆cdel(t)基因，圖位克隆法被用于本研究中，通過構(gòu)建cdel(t)位點(diǎn)的高密度物理圖譜，最終將cdel(t)基因定位于第2染色體分子標(biāo)記IDl0和ID11之間7.5kb的區(qū)段。序列分析顯示在7.5kb的區(qū)段內(nèi)僅有一個(gè)預(yù)測基因，即谷氧酸t(yī)R