水稻類病斑突變體lm-ZH基因的圖位克隆與功能分析.pdf

1、本研究通過EMS誘變水稻品種中花11種子獲得一個(gè)類病斑突變體，命名為：lm-ZH。隨后對其開展表型分析、抗性鑒定、基因定位與克隆、基因功能分析等相關(guān)工作，獲得的主要結(jié)果如下：
　　1.在大田種植條件下，lm-ZH經(jīng)播種移栽60天左右，其下部葉片葉尖處開始出現(xiàn)針點(diǎn)狀紅褐色壞死斑點(diǎn)。斑點(diǎn)數(shù)目和單個(gè)斑點(diǎn)面積隨植株生長發(fā)育不斷擴(kuò)大，至抽穗后，逐漸發(fā)展至所有葉片、葉鞘以及穎殼表面。DAB染色結(jié)果表明：lm-ZH類病斑葉片中有大量H2O2積累

2、。相較于ZH11，lm-ZH類病斑葉片對真菌幾丁質(zhì)和細(xì)菌鞭毛蛋白更為敏感，經(jīng)其處理后，葉片中活性氧生產(chǎn)速率和積累峰值均明顯高于 ZH11?？剐澡b定結(jié)果顯示：lm-ZH對稻瘟病菌和白葉枯病菌的抗性均有顯著增強(qiáng)。防衛(wèi)相關(guān)基因OsPR1a、OsPR1b、OsPR10、OsPAL1、OsAOS2及WRKY45在lm-ZH類病斑葉片中被激活顯著上調(diào)表達(dá)。
　　2.遺傳分析結(jié)果表明：lm-ZH類病斑表型受一對隱性核基因控制。以lm-ZH為母本

3、，南京11為父本雜交獲得F2分離定位群體，通過圖位克隆將lm-ZH類病斑基因精細(xì)定位于2號染色體長臂上位于標(biāo)記ZN36和ZN9之間的123KB物理區(qū)間內(nèi)。經(jīng)測序比對后發(fā)現(xiàn)：第13個(gè)開放閱讀框的第一內(nèi)含子和第二外顯子的銜接處發(fā)生了8個(gè)堿基缺失以及11個(gè)堿基替換的突變，致使mRNA加工過程中第二外顯子上28個(gè)堿基被錯(cuò)誤切除，最終導(dǎo)致蛋白翻譯的提前終止。該基因編碼一個(gè)CULLIN蛋白，在水稻體內(nèi)組成型表達(dá)。進(jìn)化分析結(jié)果顯示：其與擬南芥CUL3

4、a基因親緣關(guān)系最近，遂命名為：OsCUL3a。來自ZH11的OsCUL3a基因組DNA片段能有效恢復(fù)lm-ZH類病斑表型。
　　3.酵母雙雜交、LCI及Bi-FC結(jié)果表明：OsCUL3a與OsRBX1a/b在體內(nèi)均能互作。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示：OsCUL3a和OsRBX1a/b在水稻原生質(zhì)體的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布。隨后通過LCI和Co-IP實(shí)驗(yàn)證明：OsCUL3a在體內(nèi)與OsNPR1互作。在ZH11、lm-ZH及互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因材料p

5、OsCUL3a的原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)OsNPR1后發(fā)現(xiàn)：OsCUL3a參與介導(dǎo)OsNPR1經(jīng)由26S蛋白酶體被降解的過程。在lm-ZH背景下敲除OsNPR1后，oscul3a/osnpr1表現(xiàn)出細(xì)胞死亡執(zhí)行障礙，類病斑表型得以恢復(fù)，葉片中防衛(wèi)相關(guān)基因OsPR1a、OsPR1b及OsPR10的表達(dá)亦降低至正常水平。
　　以上結(jié)果充分說明：lm-ZH類病斑表型由OsCUL3a功能缺失突變引起。OsCUL3a通過靶向降解OsNPR1而負(fù)調(diào)